挤压膨化对美藤果饼粕蛋白的理化及功能性质的影响

朱燕丽 范小平 邹子爵 杜冰 姚继明 张英东 范文君

摘要：对美藤果饼粕蛋白通过双螺杆挤压前后的理化及功能性质进行了研究和分析，旨在为美藤果饼粕的深加工提供一定参考。结果表明，美藤果饼粕蛋白在挤压后，氮溶解指数、持水性、持油性、乳化性、起泡性和游离巯基含量均有所下降，蛋白质体外消化率增加了26.91%，必需氨基酸损失了9.74%，非必需氨基酸增加了5.89%；蛋白质等电点在挤压后由4.5下降至3。傅里叶红外光谱分析表明，美藤果饼粕蛋白在挤压前后的特征吸收峰无明显差异；热分析表明，美藤果饼粕蛋白在挤压前峰值温度较高，热稳定性较好，而挤压后的蛋白峰值温度下降；微观结构观察表明，挤压后的美藤果饼粕蛋白变成散乱的、体积较小的无规则块状结构。

关键词：美藤果饼粕；蛋白；挤压膨化；理化性质；功能性质

中图分类号：TS201.21      文献标志码：A     文章编号：1000-9973（2023）04-0043-07

Abstract： The physicochemical and functional properties of protein from sacha inchi cake before and after twin-screw extrusion are studied and analyzed， aiming to provide some references for the deep processing of sacha inchi cake. The results show that after extruding protein from sacha inchi cake， the nitrogen soluble index， water holding capacity， oil holding capacity， emulsification， foaming and free sulfhydryl content decrease， and the protein digestibility in vitro increases by 26.91%， the essential amino acids lose 9.74% and non-essential amino acids increase by 5.89%; the isoelectric point of protein decreases from 4.5 to 3 after extrusion. Fourier infrared spectroscopy analysis shows that there's no significant difference in the characteristic absorption peaks of sacha inchi cake protein before and after extrusion. Thermal analysis shows that the peak temperature of sacha inchi cake protein is higher before extrusion， and the thermal stability is better， but the peak temperature of sacha inchi cake protein decreases after extrusion. Microstructure observation shows that the extruded sacha inchi cake protein becomes scattered， small and irregular blocky structures.

Key words： sacha inchi cake; protein; extrusion; physicochemical properties; functional properties

美藤果（sacha inchi）是一种原生长于亚马逊雨林的坚果[1]，因其具备高功能价值而备受关注，于2006年由中国科学院成功引入到西双版纳热带植物园，能适应海拔为200～1 500 m的高光生长条件[2]，是一种野生、半木质、大戟科油料植物，已被世界其他地区公认为是具有商业应用价值的可持续作物，具有巨大的经济潜力[3]。美藤果当年种植即可挂果，且一年四季皆可开花结果，2～3年即进入盛产期，产量较高。美藤果种籽以直径为3～5 cm的胶囊形式包含在果实中，在成熟过程中由绿色变为黑褐色，是一种含有高水平的油脂（30%～60%）、蛋白质（25%～30%）、氨基酸、维生素、植物甾醇、生育酚等生物活性物质[4]的高营养价值农产品。

美藤果是一种富含α-亚麻酸（ω-3）和亚油酸（ω-6）等不饱和脂肪酸的极佳新型油源选择，其种籽主要用于榨油，因其具有抗氧化和抗炎功效而被广泛应用，但其直接副产物（饼粕）具有很重且难以消除的涩味和苦味，目前大部分被当作废弃物或部分用于饲料加工，较少用于食品工业，耗费了大量能源。另外，美藤果饼粕中含有丰富的营养物质，其中蛋白质含量（干基）高达59%以上，含有成年人所需的必需氨基酸，而有研究表明适当的热处理可改善美藤果本身的品质[5-6]。目前，在将被视为废品的物质转化为可食用的膳食成分的热处理中，挤压膨化技术已显示出了明显优势[7]。挤压膨化技术是通过在高温、短时间内机械剪切原材料，导致生物聚合物中的共价键断裂，加剧结构破坏的物理技术[8-9]，具有应用范围广、产物形状多样化、能量利用高等優点[10]，能杀死致病菌，钝化或使不良酶变性，尽可能地保留了食物本身的风味，综合提高了食品的安全性且可实现基本无废弃物排出，具有适合工业生产的潜力。

目前国内外关于美藤果的应用集中于含量及组成分析上，对美藤果饼粕蛋白的研究及应用报道较少，而挤压技术目前应用较多的是大豆蛋白与花生蛋白，对美藤果饼粕蛋白的挤压工艺尚鲜见研究报道。因此，本文研究了双螺杆挤压对美藤果饼粕中蛋白质主要功能和理化性质的影响，揭示其变化规律，为改进挤压加工工艺，促进美藤果饼粕的深加工及在食品加工中的应用提供了参考，并为其他高蛋白、高脂肪原料的挤压加工提供了示范。

1 材料与方法

1.1 实验材料和设备

美藤果饼粕：来自普洱联众生物资源开发有限公司，干基条件下含有60%的蛋白质、21%的脂肪、5%的灰分；DS32双螺杆挤压机。

1.2 实验方法

美藤果饼粕挤压的参数：机筒Ⅰ区温度70 ℃，Ⅱ区温度80 ℃，Ⅲ区温度115 ℃，物料含水量24%，主电机转速25 Hz，喂料速度14 Hz。

美藤果饼粕挤压前后样品中的蛋白质提取和干燥分别采用夏克东[11]的碱溶酸沉提取法、冷冻干燥法。

1.3 美藤果饼粕蛋白挤压前后的功能性质测定

1.3.1 持水性（WHC）测定

参照于明晓等[12]的测定方法，具体操作：准确称取1.0 g蛋白样品（W1）于10 mL塑料離心管中，缓慢加入5 mL蒸馏水，室温下将其充分振荡、混匀，随后静置 20 min，使之充分吸水，于4 000 r/min下离心20 min，弃去上清液，立即收集残留物并称重（W2）。根据公式（1）计算美藤果饼粕蛋白的持水性：

WHC=W2-W1W1。（1）

式中：WHC为持水性，g/g；W1为蛋白样品质量，g；W2为离心后残留物质量，g。

1.3.2 持油性（OHC）测定

参照邓芝串等[13]的测定方法，并做适当调整。准确称取0.5 g蛋白样品（M1）于10 mL离心管中，加入4 mL大豆油，室温下将其充分振荡、混匀，随后静置 30 min，于4 000 r/min下离心20 min，弃去上清液（游离油），立即收集残留物并称重（M2），根据公式（2）计算美藤果饼粕蛋白的持油性：

OHC=M2-M1M1。（2）

式中：OHC为持油性，g/g；M1为蛋白样品质量，g；M2为离心后残留物质量，g。

1.3.3 氮溶解指数测定

参照赵城彬等[14]的测定方法。取一定量蛋白样品以1∶20 （g/mL）的料液比分散于中性蒸馏水中浸提1 h，使之充分溶解，于4 000 r/min离心15 min，收集上清液。使用考马斯亮蓝法测定上清液中蛋白质含量，并根据公式（3）计算美藤果饼粕蛋白的氮溶解指数：

N=P总P样×100%。（3）

式中：N为氮溶解指数，%；P总为溶液中总的蛋白质含量，mg/mL；P样为样品中蛋白质含量，mg/mL。

1.3.4 乳化性测定

参照夏克东等[15]的测定方法。蛋白质的乳化性可用乳化活性指数（emulsification activity index， EAI）来表示。向蛋白样品液（浓度2%，20 mL）中加入等体积的大豆油，使用均质机以10 000 r/min均质2 min，吸取底层乳状液（10 μL）与10 mL 0.1%十二烷基磺酸钠（SDS）混合均匀，以0.1%的SDS溶液作为参比，在波长为500 nm处测定吸光值，并根据公式（4）计算美藤果饼粕蛋白的乳化性：

EAI=2.303×2×A500×NΦ×L×C×10 000。（4）

式中：EAI为乳化性，cm2/g；N为稀释倍数；Φ为油相体积分数，0.5；L为比色皿光径，1 cm；C为蛋白质浓度，mg/mL； A500为500 nm处的吸光度值。

1.3.5 起泡性测定

参照李维瑶等[16]的测定方法，并做适当调整。准确称取3.0 g饼粕蛋白样品，用蒸馏水配制成3%浓度的中性蛋白溶液，使用均质机以10 000 r/min均质2 min，迅速转入250 mL量筒中，准确记录泡沫体积，并根据公式（5）计算美藤果饼粕蛋白的起泡性：

F=V2-100V1×100%。（5）

式中：F为起泡性，%；V2为均质结束时泡沫总体积，mL；V1为搅拌前体积，mL。

1.3.6 游离巯基（SH）测定

参照经Beveridge等[17]改进后的Du等[18]的测定方法。主要试剂配制及方法见表1。

总巯基和暴露巯基含量测定：分别准确称取15 mg饼粕蛋白样品至5 mL A液（暴露巯基含量测试液）和B液（总巯基含量测试液）中，添加50 μL C液，于25 ℃下保温1 h后，在25 ℃ 下离心（10 000 r/min，10 min），收集上清液并在波长412 nm处测定吸光值，根据公式（6）计算美藤果饼粕蛋白的巯基及二硫键含量：

SH=73.53×A412×DC。（6）

式中：SH为蛋白的巯基及二硫键含量，μmol/g；A412为去除试剂空白后样品的吸光度值；D为稀释倍数；C为蛋白含量，mg/mL。

1.3.7 蛋白质体外消化率测定

美藤果饼粕蛋白的体外消化实验采用Wang等[19]的体外消化模型并稍作调整后进行。于0.1 mol/L的HCl溶液中准确加入1.0 g饼粕蛋白样品形成10 g/L的溶液，用NaOH溶液（1 mol/L）调节pH至1.5，并于37 ℃水浴5 min，以酶∶底物为1∶100的比例先后加入胃蛋白酶和胰蛋白酶，且分别在37 ℃恒温振荡器上反应、消化120 min后取样，抽滤。注意加入胰蛋白酶时应将pH调节至7.0。使用凯氏定氮法测定干燥后滤渣的粗蛋白含量，并根据公式（7）计算美藤果饼粕蛋白的体外消化率：

R=A-BA×100%。（7）

式中：R为蛋白质消化率，%；A为原始样品粗蛋白含量，mg/mL；B为饼粕蛋白经胃蛋白酶和胰蛋白酶消化后滤渣粗蛋白含量，mg/mL。

1.4 美藤果饼粕蛋白挤压前后的理化性质测定

1.4.1 氨基酸组成分析

氨基酸的测定参考GB 5009.124－2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸的测定》[20]。

1.4.2 蛋白等电点测定

参照孙小斐等[21]的测定方法。称取5.0 g饼粕蛋白样品粉末于烧杯中，与100 mL蒸馏水混合并搅拌均匀（pH 10.5）后于水浴锅中搅拌浸提（42 ℃，1 h），随后导入离心管中离心（室温，4 000 r/min，20 min）。取等量上清液，用NaOH溶液和HCl溶液（0.1 mol/L）分别调节pH至一定梯度，以上述相同离心条件离心。取上清液并立即采用考马斯亮蓝法测其蛋白质残留量。所测蛋白质残留量最低的上清液的pH便是美藤果饼粕蛋白的等电点。

1.4.3 傅里叶红外光谱分析

称取少量挤压前后的美藤果饼粕蛋白样品粉末，充分干燥至恒重（以去除水分干扰），加入至已干燥的溴化钾（KBr）粉末中混合并充分研磨（玛瑙研磨器）至粉末状。随后装入模具内，压制成透明薄片后于室温和干燥条件下置于傅里叶变换红外光谱仪的变温附件中进行分析，红外扫描波数为400～4 000 cm-1，分辨率为4 cm-1，信号扫描次数为64次，得出美藤果饼粕蛋白挤压前后的红外光谱图。

1.4.4 热分析（DSC）

称取冷冻干燥后的美藤果饼粕蛋白样品（约8 mg）于配套的固体铝盘中并密封，采用差示扫描热量仪扫描，并使用空铝盘作为参考。在20～180 ℃的温度范围内以 10 ℃/min的升温速率加热，N2流量为40 mL/min，默认使用基线。用仪器自带软件绘制DSC曲线，峰谷温度为变性温度，曲线形成的峰所包括的面积理论上为美藤果饼粕蛋白变性所吸收的热量。

1.4.5 扫描电镜分析

美藤果饼粕蛋白挤压前后的样品经镀金处理后采用扫描电子显微镜（SEM）观察其微观结构，以500倍和2 000倍的放大倍数拍摄图像。

1.5 数据处理

为了确保良好的重现性，所有实验数据均平行测定3次，基础数据采用Excel处理，作图采用 Origin 2021b软件。

2 结果与讨论

2.1 美藤果饼粕蛋白挤压前后功能性质变化分析

由表2可知，美藤果饼粕蛋白挤压后的持水性和持油性分别下降了4.95%和20.22%，而小麦蛋白挤压后持水性增加了70.21%[22]，这是由于美藤果饼粕蛋白在高温、高压和强剪切力的挤压后，物料未能很好地膨化，未能形成疏松的分子结构，而受内部孔隙度的影响[23]，致密的结构会阻碍水和油的渗透，所以挤压后的美藤果饼粕蛋白的持水性和持油性下降。在这种挤压条件下蛋白质发生了变性，导致可溶性蛋白含量减少，暴露出了许多疏水基团，使得气液表面张力降低，所以挤压后的氮溶解指数、乳化性和起泡性都下降了，其中氮溶解指数下降尤为显著，为81.88%，其次是起泡性（下降64.71%），乳化性下降53.50%。此外，蛋白质中的含硫氨基酸和巯基在挤压机内部的高温高压环境下可能发生了热分解，导致挤压后游离巯基含量降低了31.50%。但是，美藤果饼粕蛋白挤压后的体外消化率却增加了26.91%，这与大量研究中挤压后蛋白质消化率都会有所提高的结论相一致[24-26]，且已发现相较于其他传统热处理，挤压热处理程序对于物料蛋白质消化率的提高最有潜力[27]，最终产品的蛋白质消化率可达到90%[28]。挤压后消化率的提高可能是由于粒径减小且形成了易酶解的蓬松结构，使得消化酶的接触面积增大、接触频率增加[29]，同时还与原料成熟度有关，赵国华等[30]发现豆豉蛋白质的消化率随成熟时间的延长而增加。从美藤果饼粕蛋白的微观结构来看，经挤压后的美藤果饼粕体积结构明显缩小，挤压中的高温高压也使美藤果饼粕得以熟化，还破坏了蛋白质的束缚力，从而使分子结构舒展，分子键和二硫键部分断裂，内部氨基酸残基暴露便于消化酶接触，因此提高了美藤果饼粕蛋白的消化率。

2.2 美藤果饼粕蛋白挤压前后理化性质变化分析

2.2.1 美藤果饼粕蛋白挤压前后氨基酸含量变化分析

由表3可知，美藤果饼粕蛋白经挤压后，总氨基酸含量无明显变化，必需氨基酸损失了9.74%，非必需氨基酸增加了5.89%。其中损失率在10%以上的氨基酸有6种，尤其是蛋氨酸，损失了48.99%，最少的是缬氨酸，损失了12.32%；而有4种氨基酸增加了10%以上，苯丙氨酸最多，为29.86%，婴幼儿必需的有氨基酸（组氨酸）的增加幅度相对最小，为11.55%。

这种部分氨基酸增多，而部分氨基酸却有所损失的情况，与张晓梅等[31]在挤压青稞研究中的发现相似。美藤果饼粕蛋白质经过挤压机内高温、高压及强剪切力的影响，导致蛋白质发生不可逆变性，三级结构和四级结构的结合力变弱，暴露了部分原本封闭的疏水性氨基酸残基，与还原糖或其他羰基化合物等物质结合（美拉德反应），导致部分氨基酸有所损失。蛋白质结构遭到破坏转变为肽链结构（其在人体内易水解为氨基酸而被消化吸收），或者发生水解转变为氨基酸小分子，使得部分氨基酸含量有所增加，在不丧失原有风味的基础上增加了食品营养成分含量。

2.2.2 美藤果餅粕蛋白挤压前后等电点变化分析

一般来说，蛋白质分子结构的大小和表面电荷的分布是影响蛋白质溶解度的主要因素[32]，蛋白质的溶解度在等电点附近是最低的，即吸光度最小，上清液中蛋白质残留量最小，因为此时蛋白质所带正电荷和负电荷相等，蛋白质分子之间的静电排斥作用最小而相互聚集沉淀，所以析出的蛋白量最大。由图1可知，当pH值为4.5时美藤果蛋白的吸光度最小，即上清液中蛋白质的残留量最小，因此选择pH 4.5为美藤果蛋白的等电点。由图2可知，当pH值为3时挤压后美藤果蛋白的吸光度最小，因此选择pH 3为挤压后美藤果蛋白的等电点。美藤果蛋白挤压后等电点降低，与李小鹏[33]关于麦麸皮蛋白挤压后的结果类似，可能是在高温、高压、强剪切力的挤压条件下，原有蛋白质结构被破坏，蛋白质分子发生变性伸展，以及各种氨基酸不同程度损失所导致。

2.2.3 傅里葉红外光谱测定美藤果饼粕蛋白挤压前后二级结构变化

1 700～1 600 cm-1波段是蛋白质分析中最常用的酰胺Ⅰ区，是蛋白质中CO部分的振动拉伸的特征[34]。酰胺Ⅰ区特征频率取决于CO和H－N之间的氢键性质，而这一氢键正是构成蛋白质二级结构的基础。由图3可知，挤压蛋白于1 610～1 600 cm-1处的特征吸收峰呈现蓝移，可能是挤压温度影响了美藤果饼粕蛋白质的构象，破坏了分子内的氢键，导致峰向更高的波数移动。另外，在3 500～3 100 cm-1波段（－OH伸缩振动）和1 640～1 500 cm-1波段（N－H内弯曲振动）有明显的吸收峰，但美藤果饼粕蛋白挤压前后的特征吸收峰无明显差异，挤压后的光谱图中没有发现新的吸收谱带生成，可见在美藤果饼粕蛋白挤压过程中并没有形成新的酰胺键。

2.2.4 挤压对美藤果饼粕蛋白热力学性质（DSC）的影响

美藤果饼粕蛋白挤压前后DSC曲线见图4。

由图4可知，挤压前，美藤果饼粕蛋白原料峰值温度达到92.9 ℃；挤压后，降至88.8 ℃。峰值温度与蛋白质结构和构象、疏水键和氨基酸组成有关。在米糠蛋白的热行为研究中，峰值温度呈现出随温度升高而降低的现象，其归因于干热处理导致的氢键断裂[35]。He等[36]也指出热处理会使吸热较少的球蛋白变性，降低球蛋白的热稳定性。美藤果饼粕蛋白挤压前的峰值温度较高是因为其变性程度较低，热稳定性较高，而经过高温、高压和强剪切力的挤压膨化后，美藤果蛋白发生了很大程度的变性，致使挤压后的美藤果蛋白峰值温度降低，热稳定性也随之下降。

2.2.5 美藤果饼粕蛋白挤压前后的扫描电镜分析

由图5可知，天然状态下美藤果饼粕蛋白以散乱的无规则形式存在，表面有小颗粒。挤压膨化后的美藤果蛋白，原有的形态被破坏，变成散乱的体积较小的无规则块状结构。挤压的热处理方式破坏了饼粕蛋白分子内的氢键，削弱了分子间的相互作用，破坏了饼粕蛋白的高级结构，导致饼粕蛋白分解成小分子颗粒。另外，美藤果饼粕蛋白还发生了蛋白质的变性和化学键的断裂与重组，组织结构遭到严重破坏。山羊奶受热量影响的研究中也发现热处理可使蛋白质间相互作用引起颗粒部分聚集，蛋白质形状不规则且获得了致密的网状结构[37]。

3 结论

受挤压过程中温度、螺杆转速、进样量以及物料本身的性质等因素的影响，美藤果饼粕蛋白发生了变性、热分解且未能膨化而形成了致密的内部结构，阻碍了其部分功能性质的发挥。但是挤压后美藤果蛋白的束缚力受损，分子结构舒展，导致分子键和二硫键部分断裂，内部氨基酸残基暴露，便于消化酶接触，提高了蛋白质的消化率。另外，美藤果蛋白挤压后的热稳定性、等电点下降，必需氨基酸损失，非必需氨基酸增加，没有发现新的吸收谱带和新的酰胺键生成，但是原有的形态被破坏，蛋白分子破碎，发生分解变成了散乱的体积较小的无规则块状结构。

美藤果饼粕中含有丰富的营养物质，然而针对美藤果饼粕蛋白的加工研究还很少。挤压膨化技术是一种新型的食品加工技术，具有成本低、生产效率高、经济环保等优点，可用于开发功能性产品，具备广阔的应用前景，可将挤压膨化技术用于加工美藤果饼粕蛋白，进一步探究挤压过程中双螺杆转速、挤压温度、固液进样量等对美藤果饼粕蛋白的影响，为美藤果饼粕蛋白用于开发功能性食品的制备工艺提供了参考。

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