诱导牙髓干细胞神经向分化的研究进展

陈冠宇 冯红超

[摘要] 牙髓干细胞来源于神经嵴细胞，与其他来源的干细胞相比，具有更高的神经源性潜能。牙髓干细胞可以分化为雪旺细胞、胶质细胞以及神经元前体细胞，弥补了神经元细胞缺乏再生能力的缺陷。牙髓干细胞还可分泌神经营养因子，修复和保护神经。本文就目前诱导牙髓干细胞神经向分化的研究进展作一综述。

[关键词] 牙髓干细胞；神经细胞；神经诱导；诱导因子；神经向分化

[中图分类号] R782      [文献标识码] A      [DOI] 10.3969/j.issn.1673-9701.2023.02.028

牙髓干细胞（dental pulp stem cells，DPSCs）在2000年被Gronthos等[1]首次分离出来并进行鉴定，发现其具有多向分化的能力，其中就包括神经向分化的能力。DPSCs与其他成体干细胞不同，其来源于神经嵴，因此具有更高的神经源性潜能[2]。据文献报道，Martens等[3]从未分化的DPSCs中，检测出了早期神经标志物巢蛋白（Nestin）和波形蛋白，神经元标志物β和波形蛋白，神经元标志物β和p75，以及星形胶质细胞标志物S100蛋白。DPSCs来源广泛，可从因治疗需要而拔除的正畸牙或第三磨牙中获取，由于离体牙属于病理性医疗废物，不会引起伦理道德上的争议，且其免疫原性低，排异反应小，成为组织工程研究的热点。

1  诱导DPSCs神经向分化

DPSCs来源于神经嵴，这也使DPSCs能够在没有预诱导分化的情况下表达神经元标志物，如Nestin、p75等。目前优化DPSCs神经向分化的方法可以分为两种，第一种最常用，是将提取的DPSCs与诱导因子在一定条件下进行培养，继而检测诱导因子对DPSCs中神经因子表达的调控作用，最后得出DPSCs向神经样细胞分化的结论。第二种则是有部分学者通过采取改变培养条件的方法来优化DPSCs神经向分化。

1.1  通过诱导因子诱导DPSCs神经向分化

获取原代DPSCs后，在其传代和培养过程中，加入神经诱导因子，以此促进DPSCs的神经向分化是一种比较常用的诱导方法，常用的神经诱导因子有碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，bDNF）、表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）等。有文献报道，在对DPSCs经过神经诱导后，细胞向神经胶质样细胞分化。尼尔样-1型分子（Nel-like molecule-1，Nell-1）不仅可以促进成牙本质细胞的分化和牙本质的形成，而且其本身还可以与神经标志物共同表达[4]。研究表明，Nell-1在诱导DPSCs向神经样细胞分化中起积极作用[5]，如大鼠的牙髓组织在经过Nell-1作用后，P物质、神经元特异性烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE）和Nestin等神经标志物的表达明显增加；在通过对Nell-1诱导后的人DPSCs的检测中，发现其胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）、Nestin和β-tubulin等神经标志物的表达也有明显增加。

bFGF作为常用的神经诱导因子，在诱导DPSCs神经向分化的研究中也较为多见，例如Rafiee等[6]通过利用肝素来稳定bFGF，以此提高bFGF因子的存活率，从而更好地诱导DPSCs神经向分化；另外一项研究则是使用3D多孔壳聚糖支架为DPSCs的存活和神经分化提供了适宜的环境，并发现在将壳聚糖支架聯合bFGF应用时，可促进DPSCs的神经向分化[7]；而在Farhang等[8]的研究中，则是分别使用了bFGF和音猬因子（sonic hedgehog，SHH）两种神经诱导因子，结果表明在悬滴法培养条件下使用SHH诱导培养后的DPSCs分化为神经元样细胞的效率更高。邓轩等[9]在对人乳牙牙髓干细胞的研究中，miR-20通过激活骨形态发生蛋白信号通路，从而促进牙髓干细胞向神经元样细胞分化。近期有学者成功的从人的牙髓中提取出脱细胞基质水凝胶（hydrogel derived from human dental pulp，hDDPM-G）[10]，并将DPSCs接种在hDDPM-G涂层表面上，通过含有bFGF的预诱导液对进行培养后，再使用神经诱导液（含羟基苯甲醚、毛喉素、β-巯基乙醇等诱导因子）进行诱导，发现hDDPM-G能够更好地激发DPSCs的分化潜能，诱导DPSCs分化为神经样细胞，而且这种方法减少了牙髓组织的使用量，为诱导DPSCs神经向分化提供了一个优化方案。综上，研究人员需要更系统和广泛的研究，探索不同诱导因子对DPSCs神经向分化的诱导效率，阐明各种诱导因子对DPSCs神经向分化的的关键作用和相关机制，从而探究最佳的神经诱导条件。

1.2  优化培养条件促进DPSCs神经向分化

多数学者在研究DPSCs的神经向分化时，常常局限于对诱导因子的使用，但有文献报道显示，当使用的诱导因子不变时，比较常规培养基和无血清条件的培养基两种培养条件下诱导的DPSCs，发现无血清培养条件下DPSCs衍生的神经球中的表达比常规培养条件下的DPSCs中更显著[11]。Farhang等[8]在DPSCs神经向诱导的实验中，发现悬滴法（3D细胞培养法）比组织培养板（2D细胞培养法）条件下诱导的DPSCs具有更高的神经源向潜能。Luzuriaga等[12]在研究中发现，使用bDNF联合神经营养因子3（neurotrophins-3，NT-3）诱导DPSCs神经向分化时，无血清培养基中诱导的DPSCs比在10%胎牛血清诱导的DPSCs向神经元和神经胶质细胞分化的潜力大大增加。另外，现有的研究主要是在一些特殊条件（高糖、缺氧等）下对DPSCs进行成牙本质向分化，成骨分化[等方面的诱导[13-14]，或是在特殊条件检测DPSCs的分化潜能[15]，对DPSCs神经向分化的研究较少，Matsumura等[16]等发现缺氧条件下经过神经诱导的DPSCs更具有活力。

2  关于DPSCs不同的神经诱导方案

在DPSCs神经向诱导的研究中，虽然已经取得了相当不错的进展，但是仍存在很多障碍。多项研究利用神经诱导体系已经成功诱导DPSCs神经向分化[5-7，10-11，17-18]，Nestin和βstin10，11作为主要的神经元标志物，许多研究在鉴定DPSCs是否具有神经向分化能力时，都对其进行了检测，且在诱导后两种标志物的表达都得到了显著提升，这使得对Nestin和βstin到了显著提的检测结果成为了鉴定DPSCs是否神经向分化有力证据之一。另外，Guo等[19]的研究表明通过基因敲除热休克蛋白27，可以促使DPSCs分化为少突胶质前体细胞。Stanwick等[20]发现转化生长因子受体2（transforming growth factor receptor 2，TGFBR2）的缺失减少了DPSCs神经轴突的生长，并推断TGFBR2在牙齿矿化和神经支配过程中具有引导神经轴突生长的能力。阶段特异性胚胎抗原4（stage-specific embryonic antigen-4，SSEA-4）是鉴定多能胚胎干细胞的标志物之一，有研究表明，对SSEA-4呈阳性的人类脱落乳牙牙髓干细胞（stem cells from human exfoliated deciduous teeth，SHEDs）在经过神经诱导后，其在形态和功能上都与神经元前体细胞类似[21]。但是在众多的神经诱导方法中，哪种方法是最成功、最高效、最适合推广的，目前无法得出一个准确的结论。既往研究结果表明DPSCs神经向诱导后的培养物中产生了表达神经元标志物的神经元样细胞，在形态和功能上具有相似的生物学行为，但无法证实其为真正意义上的神经元细胞。

3  DPSCs参与神经修复

神经损伤是一种常见的疾病，可能是外伤、肿瘤手术、感染等因素所致。神经损伤后难以自我恢复，主要是因为神经元细胞缺乏再生能力，神经营养因子生成不足，细胞处于神经生长抑制因子分泌的环境。一直以来，神经损伤的修复都是医学界关注的焦点和难点。

关于DPSCs在神经修复及神经系统性疾病上的应用，目前大多数的研究是在动物模型上进行，并且在脊髓损伤[22]、阿尔茨海默症[23]、帕金森病[24]的治疗上取得了一些成效，也证明了DPSCs非常有希望成为修复神经损伤以及治疗神经系统性疾病的干细胞来源[6]。例如，Takaoka等[25]将DPSCs诱导分化为神经谱系细胞（neural lineage cells，NLCs）后，移植到免疫缺陷大鼠体内，观察到NLCs轴突伸长，髓鞘再生，并且大鼠的肌肉萎缩得到改善。有研究表明，在脑梗小鼠模型的实验中，与DPSCs相比，N-DPSCs的移植能够更好的改善脑梗死后的功能恢复[16]。Wang等[18]研究发现经过神经诱导的DPSCs（neural-induced DPSCs，N-DPSCs）分泌物可以促进雪旺细胞的增殖，并证实N-DPSCs和DPSCs均能促进大鼠坐骨神经挤压伤后运动功能的恢复。Luo等[26]的研究表明，与单独使用DPSCs相比，DPSCs联合bFGF在修复中枢神经损伤方面能够更好的促进神经元再生以及大鼠脊髓损伤后的功能恢复。DPSCs和SHEDs的分泌蛋白质组，即在条件培养基（conditioned medium，CM）或细胞外囊泡（extracellular vesicles，EV）中释放的所有生物活性分子，CM和EV均能够刺激神经突生长，并在神经系统疾病和神经元损伤的动物模型中表现出神经保护作用[27]。这些研究证明了DPSCs促进神经修复的能力，也为再生医学提供了宝贵的资源，但在研究人员进入临床试验之前，必须更加彻底地研究不同物种DPSCs的生物学特性和免疫学基础。

DPSCs修复神经的机制目前尚不明确，无论是通过DPSCs直接分化为神经元样细胞来补充损失的神经细胞，还是通过DPSCs分泌的神经营养因子作用于病损区的神经细胞来修复神经，都没有获得充分的理论依据支持。综上所述，在DPSCs的分离、培养、神经向诱导以及临床应用等各方面，无不充斥着这项研究未来所面临的挑战和困难。

4  展望

基于DPSCs的研究为组织再生领域带来了光明的未来，尤其是DPSCs的神经向分化更是为神经修复及神经疾病的治疗带来了巨大希望。DPSCs不仅更容易获取，而且与神经细胞共同来源于神经嵴，因此DPSCs比其他干细胞来源具有更良好的应用前景，是治疗神经损伤的理想干细胞来源。

目前，随着生物材料广泛用于组织再生，组织再生领域也出现了一线新机，将干细胞工程与生物材料相结合，也为神经修复指明了一个新的方向。在利用DPSCs进行神经修复的研究时，最常采用的生物学材料是糖[7]，另外，如硅胶管[28]、肝素-泊洛沙姆水凝胶[29]、3D纳米纤维支架[30]等其他生物学材料也时有报道。Drewry等[31]使用神经向诱导的DPSCs及细胞外基质（extracellular matrix，ECM）设计了无生物活性支架的细胞片，DPSCs可以分泌高水平的神经营养因子，ECM可以促进轴突延伸，应用于面神经损伤时可以与神经导管结合使用，以增强其生物活性或形成独立的无支架神经导管，进一步改善面神经的恢复。总之，这些研究提供了关于DPSCs与生物学材料相结合并应用于神经修复或再生的信息，并为开发应用于神经修复或再生的新生物材料提供了难得的宝贵经验。国内有研究采用3D悬滴培养技术对前列腺上皮细胞、间充质干细胞、DPSCs进行培养，并发现3D悬滴培养法获取的细胞数量与2D贴壁培养法相比，获得了显著提升[32-33]。另外，SASAKI等[28]采用三维模拟微重力培养技术培养的DPSCs與静态3D技术培养相比，不仅在细胞数量上有显著提升，而且在细胞的分化潜能（特别是向成牙本质细胞分化）上也明显提高，但并未对其神经向分化能力进行检测，这尚需要进行更进一步的研究。

总之，自2000年DPSCs被发现后，经过国内外学者的不断探索和深入研究，DPSCs在修复神经损伤以及治疗神经系统性疾病等方面的应用已经得到了极大的发展，但就目前而言，将其真正应用到临床还为时尚早，仍需要先弄清DPSCs修复神经的机制，进一步提高DPSCs神经向分化的效率，并结合现有的科技及生物学材料，将研究成果实际应用于神经疾患的临床治疗，任重而道远。

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（收稿日期：2022-07-30）

（修回日期：2022-12-04）