无患子皂苷对甜菜夜蛾的影响及其化学成分分析

胡榕 马英姿 刘思思 陈景震 肖志红 李昌珠

摘要 为明确无患子皂苷对甜菜夜蛾的控制作用，本试验分别用添加无患子皂苷（0.25、0.5、1、2、4、8、16 mg/g）的混毒饲料喂养甜菜夜蛾 2龄幼虫，测定甜菜夜蛾幼虫存活率、幼虫发育历期、蛹重、化蛹率、卵孵化率、性比等指标。采用液相色谱-质谱联用仪（HPLC-MS）分析无患子皂苷中的主要化学成分。结果表明，喂饲后72 h，取食4 mg/g混皂苷饲料的甜菜夜蛾幼虫开始死亡，其幼虫存活率随皂苷浓度的升高而降低;相比空白对照组，取食4 mg/g混皂苷饲料的幼虫，其幼虫期延长8.55 d（P＜0.05），蛹重降低了41.13%（P＜0.05），化蛹率下降46.43%（P＜0.05）。取食0.5 mg/g以及2 mg/g混皂苷饲料的幼虫其卵孵化率分别比空白对照降低9.61%、16.12%;取食混有皂苷的饲料会扰乱甜菜夜蛾的性比，其中混入2 mg/g皂苷的处理对其性比影响最大，雌性比为25.00%。从无患子皂苷中鉴定出10种皂苷类化合物，共鉴别出6种常春藤型三萜皂苷，3种齐墩果酸型三萜皂苷，1种大戟烷型三萜皂苷。

关键词 甜菜夜蛾; 生长发育; 繁殖; 无患子皂苷; 化学成分

中图分类号： S 433.4

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2021730

Abstract In order to clarify the control effect of Sapindus saponin on Spodoptera exigua， the 2nd instar larvae of S.exigua were fed with the feed mixed with seven different concentrations （0.25， 0.5， 1， 2， 4， 8 and 16 mg/g） of Sapindus saponin. The larval survival rate， larval developmental duration， pupal weight， pupation rate， egg hatching rate and sex ratio of S.exigua were measured. The main chemical components of Sapindus saponin were analyzed by liquid chromatography-mass spectrometry （HPLC-MS）. The results showed that the death of larvae began to appear at 72 h after feeding with 4 mg/g saponin and the survival rate of larvae decreased with increasing concentration of saponin. The larval stage prolonged by 8.55 d; the pupal weight was significantly decreased by 41.13%， and the pupation rate was significantly decreased by 46.43 compared with the control group. The egg hatching rate decreased by 9.61% and 16.12%， respectively， compared with the control group when fed with 0.5 mg/g or 2 mg/g saponin. The moth sex ratio was biased by feeding saponin， and 2 mg/g saponin had the greatest impact on the sex ratio， with a female to male ratio of 25.00%. Ten saponins were identified from Sapindus， including six ivy-type triterpenoid saponins， three oleanolic acid-type triterpene saponins， and one euphorbia-type triterpene saponin.

Key words Spodoptera exigua; growth and development; reproduction; Sapindus saponin; chemical composition

甜菜夜蛾Spodoptera exigua （Hübner）是一種世界范围内的重要农业害虫［1］，威胁许多经济作物，如棉花、玉米、烟草等的生产，造成经济损失。其通过迁徙越冬而不滞育。在过去的20年里，化学杀虫剂是控制该害虫最有效的手段，包括一些传统的有机磷、拟除虫菊酯和苯甲酰脲类杀虫剂［2］，但随着这类化学杀虫剂长期的不合理使用，甜菜夜蛾已对一些药剂产生了高度抗性，且引发了农药残留以及环境污染等一系列问题［3］。因而，寻求一种无污染的生物防治方法已经成为全世界的重点研究课题之一。植物源杀虫剂具有低毒、低残留、选择范围大、可延缓害虫抗药性、开发污染小等特点［4-5］，近年来得到广泛关注。

无患子Sapindus saponaria为无患子科Sapindaceae无患子属Sapindus落叶乔木，又名木患子、肥皂树、洗手果等，主要生长在东南亚各国以及我国的长江流域，分布于淮河以南各地［6-7］，无患子是一种综合利用价值较高的经济树种，其假种皮中含有大量皂苷成分。目前有关无患子皂苷抗菌、抗肿瘤、保护心脑血管及肝脏、杀虫等方面的研究已有一些报道［8］。据报道无患子皂苷对小管福寿螺Pomacea canaliculata、斜纹夜蛾 Spodoptera litura、弧金翅夜蛾Thysanoplusia orichalcea等均有较好的抑制作用［9-11］。鉴此，本文研究了无患子皂苷提取液对甜菜夜蛾生长发育和繁殖的影响，旨在为将无患子皂苷开发成低毒、高效的植物源农药提供理论依据和科学指导。

1 材料与方法

1.1 材料

供试无患子采于湖南省浏阳市普迹镇。甜菜夜蛾幼虫及人工饲料均购买自科云生物技术有限公司，幼虫使用人工饲料饲养，成虫用5%蜂蜜水饲养。饲养条件：温度（26±2）℃，相对湿度（70±2）%，光周期L∥D=14 h∥10 h。

1.2 方法

1.2.1 無患子皂苷提取液的制备

无患子皂苷的提取方法主要包括水提法或有机溶剂提取法。水提法的提取率较高，且成本较低，适用于农业生产。因此本试验采用水提法提取，具体操作参照方译晨［12］的方法。无患子果皮中的三萜皂苷主要是齐墩果酸型，因此本试验以齐墩果酸标准品作为对照［13］。齐墩果酸标准品购自索莱宝生物科技有限公司。以齐墩果酸标准溶液质量浓度为横坐标（x）、吸光度值为纵坐标（y），得到标准曲线y=0.672 5x+0.050 1，R2=0.999 6。采用紫外-可见分光光度计测定无患子皂苷含量［14］。

1.2.2 无患子皂苷对甜菜夜蛾生长发育和繁殖的影响

参照李秀梅等［15］的饲料混毒法。将无患子皂苷提取液用蒸馏水稀释成1、2、4、8、16、32、64 mg/mL的试验浓度，取5 mL药液与20 g人工饲料充分混匀，配制成含0.25、0.5、1、2、4、8、16 mg/g无患子皂苷的混毒人工饲料，并设蒸馏水为空白对照。在24孔养虫板中加入混毒饲料，每孔分别接入1头生长状态良好，大小一致的甜菜夜蛾2龄幼虫，在温度（26±2）℃，相对湿度（70±2）%， 光周期L∥D=14 h∥10 h的智能人工气候箱中饲养，每个浓度处理20头，3次重复。人工饲料保持新鲜，以确保幼虫正常生长［16］。每隔24 h清除粪便及残留垃圾，统计幼虫死亡率、化蛹率、幼虫历期等数据，记录至幼虫全部死亡或化蛹为止［17］，幼虫化蛹后称量蛹重。幼虫死亡的判定标准为轻触试虫虫体，虫体不能自主运动者视为死亡。待蛹羽化后，记录羽化的雌雄成虫数量。挑选１雌１雄进行配对（共10对），放入成虫饲养盒中饲养，盒中放入浸润10％蜂蜜水的脱脂棉球供成虫补充营养（每天补充清水保持棉球湿润）。每天定时观察记录盒内壁雌虫的产卵情况以及卵的孵化情况［18］。

1.3 化学成分分析

无患子皂苷的化学组分采用 HPLC-MS法分析和鉴定。色谱柱：沃特世ACQUITY UPLC HSS T3 （150 mm×2.1 mm， 1.8 μm）;流动相A：0.1%甲酸水溶液;流动相B：0.1%甲酸乙腈;柱温：50℃;进样量：3 μL;梯度洗脱：起始时95%A，5%B; 10 min 时70%A，30%B; 32 min时40%A，60%B;37 min时5%A，95%B;38 min时95%A%， 5%B;流速：0.3 mL/min;检测波长：254 nm。MS条件如下：UPLC-Triple-TOF 5600+飞行时间液质联用仪：正负离子扫描模式;扫描范围：100～1 500 m/z;雾化气（GS1）：50 psi;雾化气（GS2）：50 psi;气帘气（CUR）：35 psi;离子源温度（TEM）：600℃（正）和550℃（负）;离子源电压（IS）： 5 500 V（正）和-4 500 V（负）;一级扫描：去簇电压（DP）：100 V;聚焦电压（CE）：10 V;二级扫描：使用TOF MS-Product Ion-IDA模式采集质谱数据，CID能量为±40 V和±20 V，进样前，用CDS泵做质量轴校正，使质量轴误差小于2 mg/kg。各峰经质谱计算机数据系统检索，标准图谱库Scifinder和Reaxy数据库，确定无患子皂苷中的化合物结构。

1.4 数据处理与统计分析

化蛹率=化蛹虫数/试验总虫数×100%［19］;

羽化率=羽化虫数/化蛹虫数×100%［19］。

试验数据采用 IBM SPSS Statistics 26.0软件处理。存活率、羽化率、化蛹率，性比和卵孵化率等百分比数据首先进行反正弦平方根转换。不同无患子皂苷处理下甜菜夜蛾适合度参数用Kolmogorov-Smirnov测验进行正态分布检验。非正态分布数据通过Kruskal-Wallis测验（α=0.05）进行比较。正态分布数据通过单因素方差分析（One-way ANOVA） 进行分析（α=0.05），平均数采用LSD法进行多重比较［20］。

2 结果与分析

2.1 无患子皂苷对甜菜夜蛾发育以及性比的影响

由表1可知，无患子皂苷对甜菜夜蛾的幼虫存活率、化蛹率、羽化率、卵孵化率以及雌性比均存在不同程度的影响，其中对甜菜夜蛾幼虫存活率以及化蛹率影响较大，对甜菜夜蛾的羽化率、卵孵化率以及雌性比影响较小。药后72 h，当添加的皂苷浓度达到4 mg/g及以上时幼虫出现死亡，且无患子皂苷浓度越高，幼虫存活率越低。与空白对照组相比，添加4 mg/g皂苷时，化蛹率降低46.43%（P＜0.05）;取食0.25 mg/g和1 mg/g混皂苷饲料后羽化率分别降低18.06%和11.43%;取食0.5 mg/g以及2 mg/g混皂苷饲料后卵孵化率分别降低9.61%、16.12%。取食混有无患子皂苷的饲料会扰乱甜菜夜蛾的雌性比，其中取食混有2 mg/g皂苷的处理其雌性比明显降低，为25.00%。

2.2 无患子皂苷对甜菜夜蛾幼虫期和蛹期的影响

无患子皂苷对甜菜夜蛾幼虫期有显著影响，混皂苷饲料中无患子皂苷浓度越高，对幼虫发育的抑制作用越明显（表2）。4 mg/g混皂苷饲料处理下的幼虫期（17.57 d）比空白对照组延长8.55 d（P＜0.05）。无患子皂苷对甜菜夜蛾蛹期有一定程度的影响，但蛹期与无患子皂苷浓度没有明显相关性，其中0.5 mg/g混皂苷饲料处理下的蛹期最长，与空白组相比，蛹期延长2.97 d。

2.3 无患子皂苷对甜菜夜蛾蛹重的影响

无患子皂苷对甜菜夜蛾蛹重有显著影响（图1），且浓度越高抑制作用越显著。混合0.5～4 mg/g皂苷处理组的蛹重均显著低于空白对照，其中混4 mg/g皂苷饲料处理下的蛹重最小，为0.120 1 g，相比空白組减轻了0.083 9 g。0.25、0.5、1、2 mg/g混皂苷处理甜菜夜蛾的蛹重比空白对照组依次减轻0.011 7、0.035 8、0.047 0、0.077 0 g。

2.4 无患子皂苷成分分析

无患子皂苷提取物其化学成分见表3。结合高分辨质谱结果拟合分子式，在 Scifinder和Reaxy数据库中检索，对无患子果皮中皂苷类成分进行快速筛查和鉴别，共鉴别出10种皂苷类物质，含有五环三萜皂苷类齐墩果烷型皂苷、四环三萜类大戟烷型皂苷。不同种类的无患子皂苷的主要区别在于其骨架结构、糖的种类、连接顺序和连接位置等不同，其中糖的种类主要为葡萄糖、阿拉伯糖、鼠李糖、木糖等。根据常春藤型皂苷元m/z（471/393），齐墩果酸m/z（455/407）等特征碎片离子［21］，对无患子果皮中该类成分进行快速筛查和鉴别，共鉴别出6种常春藤型三萜皂苷，3种齐墩果酸型三萜皂苷，1种大戟烷型三萜皂苷。

3 结论与讨论

一般来说，植物源杀虫剂不会直接杀死害虫，但会使害虫在接触杀虫剂后产生拒食反应，停止取食或显著减少取食量，导致其不能蜕皮进入到下一龄期，幼虫处于濒临死亡状态，最后部分害虫死亡［22］。本试验结果表明，无患子皂苷对甜菜夜蛾的生长发育及繁殖的抑制作用是多方面的，主要包括直接“杀死”害虫、显著抑制幼虫蜕皮、降低害虫蛹重、延长害虫幼虫期和蛹期等方面，以此来控制害虫群体增长速度和种群数量。甜菜夜蛾幼虫取食不同浓度无患子皂苷提取物后，其幼虫期延长，可能是因为皂苷提取液使甜菜夜蛾产生拒食现象，导致食物摄入不足，没有足够营养支撑而无法进入下一个蜕皮阶段［23］；或因取食皂苷提取物后其消化系统受损，影响营养物质的正常吸收；或因有毒化合物破坏了甜菜夜蛾体内激素平衡，导致其产生畸形虫态［24］。本研究有个别幼虫取食无患子皂苷提取液后出现延迟蜕皮，迟迟不能进入下一阶段的情况，推测是幼虫体内激素水平失衡，导致幼虫活力降低，出现畸形虫，相关作用机制有待进一步研究。

植物提取液对昆虫繁殖力有一定的抑制作用，这在当归和蓖麻乙醇提取液对甜菜夜蛾生长发育和繁殖的亚致死效应的研究中已有报道［24］。本研究中出现部分卵不能正常孵化以及个别雌虫所产卵全部不能孵化的情况。推测可能是因为无患子皂苷通过影响昆虫的内分泌系统、生殖系统以及昆虫体内相关酶系，致使成虫性腺发育成熟能力下降，生殖能力减退。具体表现为雄虫不易产生精子或精子形成后失去活力，雌虫产卵量下降或所产卵多为未受精的无效卵。

有多项研究证实皂苷类物质具有抗虫活性。如录丽平等［25］研究发现无患子中的皂苷对小菜蛾Plutella xylostella （Linnaeus）和果蝇Drosophila具有毒杀活性。Huang等［9］从无患子水提物中分离出的常春藤型三萜皂苷Mukurozi-saponin G、Mukurozi-saponin E1对福寿螺具有显著的杀螺活性，致死率高达70%～100%。另外，Upadhyay等［26］也指出无患子提取物可以抑制椎实螺Lymnaea acuminata神经组织中的乙酰胆碱酯酶（AchE）、酸性和碱性磷酸酶（ACP/ALP），从而使螺死亡。因此，三萜皂苷是无患子果皮中具有极大利用价值的一类皂苷，可以在农业生产中进一步开发利用。

本研究利用液相色谱-质谱联用仪（HPLC-MS）从无患子皂苷提取物中鉴定到大量的三萜皂苷和倍半萜皂苷，由此推测无患子皂苷中抑制甜菜夜蛾生长发育及繁殖的活性物质可能是无患子皂苷中的三萜类化合物或者是倍半萜类化合物。具体是哪种成分或者哪几种成分协同作用，以及以哪种方式起作用，作用机理等还有待进一步深入探究。进一步研究无患子皂苷对农田害虫的生物活性并对其活性成分进行分离纯化及鉴定，对合成和开发新型植物源农药和对指导无公害蔬菜生产都有重要意义。

参考文献

［1］ ZHENG Xialin， WANG Pan， CHENG Wenjie， et al. Projecting overwintering regions of the beet armyworm， Spodoptera exigua in China using the CLIMEX model ［J/OL］. Journal of Insect Science， 2012， 12：13. DOI： 10.1673/031.012.1301.

［2］ GONG Changwei， YAO Xinge， YANG Qunfang， et al. Fitness costs of chlorantraniliprole resistance related to the SeNPF overexpression in the Spodoptera exigua （Lepidoptera： Noctuidae） ［J/OL］. International Journal of Molecular Sciences， 2021， 22（9）： 5027. DOI： 10.3390/ijms22095027.

［3］ 刘向阳， 朱福兴， 张凯. 甜菜夜蛾抗药性研究现状［J］.昆虫知识， 2007（5）：632-636.

［4］ 程禹铭. 不同寄主植物对甜菜夜蛾生长发育的影响及甜菜夜蛾寄主选择的化学机制［D］. 扬州： 扬州大学， 2015.

［5］ 万年峰， 陈晓勤， 季香云， 等. 当归和蓖麻乙醇提取液对甜菜夜蛾生长发育和繁殖的亚致死效应［J］. 中国生态农业学报， 2013， 21（9）： 1135-1141.

［6］ 徐圆圆， 周思维， 陈仲， 等. 无患子不同器官中的总皂苷和总黄酮含量［J］. 南京林业大学学报（自然科学版）， 2021， 45（4）： 83-89.

［7］ 魏凤玉， 余锦城， 解辉， 等. 天然无患子皂苷的提取分离［J］. 安徽化工， 2007（3）： 15-17.

［8］ 徐圆圆， 贾黎明， 陈仲， 等. 无患子三萜皂苷研究进展［J］. 化学通报， 2018， 81（12）： 1078-1088.

［9］ HUANG Huichi， LIAO Sinchung， CHANG Fangrong， et al. Molluscicidal saponins from Sapindus mukorossi， inhibitory agents of golden apple snails， Pomacea canaliculata ［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2003， 51（17）： 4916-4919.

［10］SAHA S， WALIA S， KUMAR J， et al. Screening for feeding deterrent and insect growth regulatory activity of triterpenic saponins from Diploknema butyracea and Sapindus mukorossi ［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2010， 58 （1）： 434-440.

［11］EDDAYA T， BOUGHDAD A， SIBILLE E， et al. Biological activity of Sapindus mukorossi Gaerten （Sapindaceae） aqueous extract against Thysanoplusia orichalcea （Lepidoptera： Noctuidae） ［J］. Industrial Crops & Products， 2013， 50： 325-332.

［12］方譯晨. 无患子皂苷提取液与螯合剂联合作用修复镉污染土壤的研究［D］. 南宁： 广西大学， 2019.

［13］解辉. 无患子皂苷分离纯化的研究［D］.合肥： 合肥工业大学， 2008.

［14］张翠. 无患子总皂苷制备工艺研究［D］.无锡： 江南大学， 2012.

［15］李秀梅， 方继朝. 18种中草药提取物对褐飞虱和甜菜夜蛾的杀虫活性分析［J］. 昆虫学报， 2010， 53（3）： 298-306.

［16］丁金凤， 徐春梅， 张正群， 等. 溴氰虫酰胺对双委夜蛾生长发育、繁殖和营养利用的影响［J］. 中国农业科学， 2017， 50（22）： 4307-4315.

［17］赖添财. 甜菜夜蛾和斜纹夜蛾对氯虫苯甲酰胺的抗性风险评估［D］. 南京： 南京农业大学， 2011.

［18］鲁智慧， 和淑琪， 严乃胜， 等. 温度对草地贪夜蛾生长发育及繁殖的影响［J］. 植物保护， 2019， 45（5）： 27-31.

［19］刘瑶. 云南地区苏云金芽胞杆菌的分离鉴定和对几种鳞翅目害虫生长发育的影响［D］. 雅安： 四川农业大学， 2016.

［20］李栋， 李晓维， 马琳， 等. 温度对番茄潜叶蛾生长发育和繁殖的影响［J］. 昆虫学报， 2019， 62（12）： 1417-1426.

［21］张权， 齐梦蝶， 康莹， 等. UHPLC-LTQ Orbitrap MS快速鉴别无患子果皮中部分苷及苷元成分［J］. 质谱学报， 2018， 39（2）： 224-239.

［22］蒋春先， 熊忠梅， 李庆， 等. 用吴茱萸乙醇提取物对斜纹夜蛾的生物活性进行研究［J］. 西南大学学报（自然科学版）， 2008（2）： 105-108.

［23］孙娈姿， 王佺珍， 呼天明， 等. 菊苣叶提取物对粘虫的生物活性研究［J］. 草业学报， 2011， 20（2）： 60-66.

［24］万年峰， 陈晓勤， 季香云， 等. 当归和蓖麻乙醇提取液对甜菜夜蛾生长发育和繁殖的亚致死效应［J］. 中国生态农业学报， 2013， 21（9）： 1135-1141.

［25］录丽平， 孙长德， 杨美林， 等. 无患子皂苷粗提物杀虫活性研究［J］. 安徽农业科学， 2010， 38（2）： 10755-10756.

［26］UPADHYAY A， SINGH D K. Inhibition kinetics of certain enzymes in the nervous tissue of vector snail Lymnaea acuminata by active molluscicidal components of Sapindus mukorossi and Terminalia chebula ［J］. Chemosphere， 2011， 85（6）： 1095-1100.

（责任编辑：杨明丽）