基于指纹图谱和网络药理学的苍耳子质量标志物预测分析

敖慧豪 付梦雅 谢冬梅 朋汤义 吴德玲 韩燕全

〔摘要〕 目的 基于指紋图谱和网络药理学预测苍耳子质量标志物，为其质量控制和药效研究提供依据。方法 选择10批不同产地苍耳子饮片，采用超高效液相色谱系统Waters Acquity UPLC H-Class建立其UPLC指纹图谱，通过对照品指认确定其共有峰并初步预测其候选Q-Marker；运用网络药理学构建“核心成分-靶点-通路”网络，进一步预测苍耳子Q-Marker及核心靶点，再用分子对接方法预测分析苍耳子Q-Marker生物活性。结果 建立了10批苍耳子饮片的指纹图谱，确认了18个共有峰，通过苍耳子对照品指认了其中8个峰，分别为原儿茶醛、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、3，4-二咖啡酰奎宁酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸和4，5-二咖啡酰奎宁酸。经网络药理学分析，以上8种成分关联29个核心靶点与20条关键通路，与苍耳子抗炎、抗肿瘤等作用密切相关，可作为苍耳子药效活性成分。分子对接结果显示该8种成分与其对应的核心靶点之间均有较好的结合能力，表明苍耳子候选Q-Marker拥有较好的生物活性。结论 通过UPLC指纹图谱和网络药理学分析，预测出苍耳子的Q-Marker，为其质量及药效学的进一步研究提供了参考。

〔关键词〕 苍耳子；质量标志物；指纹图谱；网络药理学；分子对接

〔中图分类号〕R284.1       〔文献标志码〕A        〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０23.03.017

Predictive analysis of Cangerzi （Fructus Xanthii） quality markers based on

fingerprint and network pharmacology

AO Huihao1，2， FU Mengya1，2， XIE Dongmei2， PENG Tangyi1， WU Deling1， HAN Yanquan1*

1. The First Hospital of Anhui University of Chinese Medicine/The Third Class Laboratory of Chinese Medicine Preparation， National Administration of Chinese Medicine/Anhui Key Laboratory of Chinese Medicinal Formula/Anhui Engineering

Technology Research Center of Modernized Pharmaceutics， Hefei， Anhui 230601， China; 2. Anhui University of

Chinese Medicine， Hefei， Anhui 230031， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective Based on the fingerprint and network pharmacology， the quality markers of Cangerzi （Fructus Xanthii） were predicted to provide the basis for its quality control and pharmacodynamics research. Methods Ten batches of Cangerzi （Fructus Xanthii） from different habitats were selected， and their UPLC fingerprints were established by Waters Acquity UPLC H-Class. Their common peaks were identified by reference materials and their candidate Q-Markers were preliminarily predicted; network pharmacology was used to construct a "core-component-target pathway" network to further predict the Q-Markers and core targets of Cangerzi （Fructus Xanthii）， and molecular docking method was used to verify the biological activity of Cangerzi （Fructus Xanthii） Q-Markers. Results The fingerprints of 10 batches of Cangerzi （Fructus Xanthii） were established， and 18 common peaks were identified. Eight peaks were identified by the reference substance of Cangerzi （Fructus Xanthii）， namely 3，4-Dihydroxybenzalde， neochlorogenic acid， chlorogenic acid， cryptochlorogenic acid， caffeic acid， 3，4-Dihydroxybenzaldehyde， 3，5-dicaffeoylquinic acid and 4，5-dicaffeoylquinic acid. According to the network pharmacological analysis， the above 8 components are associated with 29 core targets and 20 key pathways， which are closely related to the anti-inflammatory and anti-tumor effects of Cangerzi （Fructus Xanthii）， and they can be used as the active components of Cangerzi （Fructus Xanthii）. Molecular docking results showed that the 8 components had good binding with their corresponding core targets， indicating that the candidate Q Markers of Cangerzi （Fructus Xanthii） had good biological activity. Conclusion Through UPLC fingerprint and network pharmacological analysis， the Q-Marker of Cangerzi （Fructus Xanthii） has been predicted， providing reference for further research on its quality and pharmacodynamics.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 Cangerzi （Fructus Xanthii）; quality marker; fingerprint; network pharmacology; molecular docking

苍耳子为菊科植物苍耳（Xanthium sibiricum Part．）的干燥成熟带总苞的果实，又名葈耳实、老苍头等，其味苦、甘、辛，性温，有毒，归肺经[1]；其主要功效为散风寒、通鼻窍和祛风湿，用于治疗风寒头痛、鼻塞流涕、鼻鼽、鼻渊、风疹瘙痒、湿痹拘挛等。苍耳子含有多种化学成分，主要包括水溶性苷类、倍半萜内酯类、挥发油类、脂肪油类和酚酸类等[2-7]。现代药理学研究表明，苍耳子具有降血糖、抗过敏、免疫抑制、抗菌、抗炎镇痛和抗肿瘤等作用[2-9]，临床上多用于治疗急慢性鼻炎、鼻窦炎和感冒[8-14]。苍耳子产地广泛，全国各地均有分布[15]，药材质量差异较大。因此，探索苍耳子相关质量控制技术对苍耳子的质量及药效等研究具有重要研究意义。

近年来，刘昌孝院士提出了“中药质量标志物（Q-Marker）”的新概念[16]，其以“有效性、特有性、溯源性、可测性和中医药理论关联性”为原则，为促进中医药发展，完善中药质量控制体系提供了新的研究思路。目前，中药Q-Marker已广泛应用于中药及复方制剂研究中，成为中药质量控制研究的有效手段之一[17-18]。本研究通过建立不同产地苍耳子饮片的UPLC指纹图谱，运用网络药理学进一步验证确定其质量标志物，并通过分子对接技术验证其活性，以期为进一步完善苍耳子质量控制和药效学提供参考。

1 材料

1.1  仪器

Waters Acquity UPLC H-Class超高效液相色谱系统，配有四元超高压溶剂系统、自动进样恒温样本管理器、柱温箱、PDA检测器和Empower 2色谱工作站（美国Waters公司）；KQ3200DB型超声清洗器（江苏昆山超声仪器有限公司）；XFB-200型高速中药粉碎机（吉首市中州制药机械厂）；BP211D型电子天平（德国Sartorius公司）；YM-902型高精密度防泼水pH计（姜堰市樱明仪器仪表有限公司）。

1.2  试剂

对照品：绿原酸（99.39%；批号：110753-200413）和咖啡酸（98.00%；批号：110885-200102）购自中国食品药品检定研究院：1，3-二咖啡酰奎宁酸（99.00%；批号：11042905）、原儿茶醛（99.50%；批号：1103006）、3，4-二咖啡酰奎宁酸（98.50%；批号：12041114）、3，5-二咖啡酰奎宁酸（99.20%；批号：12101101）、4，5-二咖啡酰奎宁酸（98.40%；批号：11081803）、隐绿原酸（99.00%，批号：11112203）和新绿原酸（99.00%；批號：11112202）均购自成都曼斯特化工有限公司，经1H-NMR、13C-NMR、MS、IR和UV等光谱检测确认其结构，按归一化法测得其纯度；乙腈和甲醇为色谱纯（德国SIGMA公司）；磷酸等试剂均为分析纯（天津市富宇精细化工有限公司）；水为屈臣氏蒸馏水。

1.3  材料

本研究所用10批苍耳子饮片来自不同产地（安徽六安、安徽岳西、福建厦门、合肥南郊、河北安国、河南洛阳、河南固阳、河南驻马店、四川达州、内蒙古包头。按顺序为S1-S10），经安徽中医药大学第一附属医院韩燕全主任中药师鉴定均为菊科植物苍耳（Xanthium sibiricum Part．）的成熟带总苞的果实去刺后的饮片，用前粉碎过40目筛。

2 方法和结果

2.1  苍耳子UPLC指纹图谱的建立

2.1.1  色谱条件  Waters Acquity UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱程序为：0～2 min，3%-5% A；2～8 min，5%-10%A；8～8.5 min，10%-15%A；8.5～14 min，15%-20%A；14～17 min，20%-24%A；17～20 min，24%-35%A；20～22 min，35%-50%A；检测波长为220 nm；流速0.25 mL/min，柱温30 ℃。

2.1.2  对照品溶液的制备  精密称定新绿原酸、原儿茶醛、绿原酸、咖啡酸、隐绿原酸、1，3-二咖啡酰奎宁酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸、3，4-二咖啡酰奎宁酸和4，5-二咖啡酰奎宁酸对照品适量，分别置于棕色量瓶中甲醇溶解，制得各对照品溶液。分别取对照品溶液各一定量逐次稀释，得到浓度分别为10.120、4.573、44.400、2.680、3.093、2.507、29.333、3.613和9.480 μg/mL的混合对照品溶液。

2.1.3  供试品溶液的制备  精密称取苍耳子药材粉末0.3 g，置于10 mL棕色量瓶中，甲醇定容至刻度，超声提取30 min（150 W，40 kHz），放至室温，加甲醇补足损失体积，摇匀，再次静置，临用前用0.22 μm滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.1.4  精密度试验  取S1号苍耳子供试品溶液，按照“2.1.1”项下的色谱条件连续进样6次，记录色谱图，以5号峰为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示，各共有峰相对保留时间RSD均小于0.85%，相对峰面积RSD均小于1.25%，表明仪器精密度良好。

2.1.5  重复性试验  取苍耳子药材S1号样品平行制备6份供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样分析，记录色谱图。以5号峰为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示，各共有峰相对保留时间RSD均小于1.32%，相对峰面积RSD均小于1.64%，表明该方法重复性良好。

2.1.6  稳定性试验  取苍耳子供试品溶液（编号S1），于室温放置0、2、4、8、12、24 h时按“2.1.1”项下色谱条件进样分析，记录色谱图。以5号峰为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示，各共有峰相对保留时间RSD均小于0.89%，相对峰面积RSD均小于1.14%，表明供试品溶液在室温放置24 h内稳定性良好。

2.1.7  指纹图谱的建立  将10批苍耳子药材色谱图依次导入国家药典委员会研制的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012.130723版本）中，以S1为参照谱图，采用中位数法，时间窗宽度0.1，得到10批苍耳子药材的叠加UPLC指纹图谱（图1）和苍耳子对照指纹图谱（图2），得到18个共有峰，以对照指纹图谱R为参照，其相似度分析结果见表1，各批次苍耳子与对照指纹图谱相似度均>0.900。

2.1.8  指纹图谱共有峰指认  对10批苍耳子药材进行指纹图谱分析，得到18个共有峰，通过与对照品指认，确认了8个共有峰，见图2。

2.2  苍耳子网络药理学分析

苍耳子所含化学成分种类较多，其中酚酸类成分作为苍耳子的主要药效成分，具有多种药理作用[19-20]。因此，基于中药质量标志物可测性和溯源性，将以上指认的8个酚酸类成分作为苍耳子Q-Marker候选成分。

2.2.1  苍耳子候选化合物靶点预测及成分-靶点网络的构建  将上述筛选出来的8个Q-Marker候选成分（新绿原酸、原儿茶醛、绿原酸、咖啡酸、隐绿原酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸、3，4-二咖啡酰奎宁酸和4，5-二咖啡酰奎宁酸）分别通过TCMSP、SwissTargetPrediction数据库查找Q-Maker的作用靶点，去除平台间的重复项，并使用Uniprot转化为基因名，得到了与候选成分相关的118个靶点，将所有成分和靶点导入Cytoscape 3.7.2软件构建成分-靶点网络图。详见图3。

2.2.2  靶点蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction， PPI）网络分析  将选出的118个作用靶点，导入STRING数据库（http：//string-db.org/cgi/input.pl）构建PPI网络，物种选择为智人（Homo Sapiens），去除无关联的靶点，其他设置不变，生成PPI网络图。随后对PPI网络图进行拓扑特征分析，筛选degree值大于两倍中位数的点作为核心靶点，经筛选后共得到29个重要核心靶点。详见表2。

2.2.3  GO与KEGG富集分析  将已候选Q-Marker相关的29个核心靶点导入DAVID数据库中，限定物种信息为智人（Homo sapiens）进行GO与KEGG通路富集分析。GO富集分析共获得295条信号通路，其中生物进程（BP）205个，细胞组分（CC）41个，分子功能（MF）49个；KEGG富集分析共获得114个信号通路。以P＜0.01和FDR＜0.01为条件，对GO条目和KEGG通路进行筛选，选取前20个进行可视化分析。详见图5—6。

结果显示，GO富集分析主要参与的生物过程（BP）包括细胞迁移的正向调节，血管生成、肽基酪氨酸磷酸化、对脂多糖的反应、蛋白质磷酸化、凋亡过程的正向调控等。涉及膜筏、质膜、细胞质核周区等细胞组分（CC），具有酶结合、蛋白丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性、ATP结合、蛋白质结合等分子功能（MF）。KEGG富集到癌症中的蛋白聚糖、脂质和动脉粥样硬化、癌症的途径、AGE-RAGE信号通路在糖尿病并发症中的作用、冠状病毒感染-COVID-19、癌症中的微小RNA、乙型肝炎、黏着斑、人类巨细胞病毒感染、PI3K-Akt信号通路等。

2.2.4  “关键成分-核心靶点-通路”网络构建和分析  本研究根据筛选得到8个关键成分，29個主要靶点、81个主要信号通路导入Cytoscape 3.7.2软件构建成分-靶点-通路网络图（见图7）。靶点MAPK1（degree 73）、PIK3CA（degree 69）、CASP8（degree 29）、EGFR（degree 37）、PRKCA（degree 47）、CASP3（degree 36）、TLR4（degree 25）、STAT3（degree 24）、ERBB2（degree 21）、MMP2（degree 18）具有较大degree值，可作为核心靶点。通路中的癌症蛋白聚糖（degree 13）、癌症中的微小RNA（degree 10）、脂质和动脉粥样硬化（degree 13）、癌症的途径（degree 15）、冠状病毒感染-COVID-19（degree 10）的degree值为两倍中位数及以上，为重要通路。

2.3  分子对接验证分析

为进一步明确核心成分和核心靶点的相关性和验证其结合活性，使用AutoDock Vina 1.5.7软件将以上8个核心成分和10个核心靶点分别进行对接。

以候选的8个核心成分为配体，在PubChem数据库中下载其3D结构sdf格式文件，以核心靶点MAPK1、PIK3CA、CASP8、EGFR、PRKCA、CASP3、TLR4、STAT3、ERBB2、MMP2为受体，在RSCB PDB数据库中物种选择“人”，下载其3D结构的pdb格式文件[21]。使用pymol和Auto Dock Tools 1.5.7软件分别对受体和配体进行去水、加氢、加电荷处理，Auto Dockvina进行分子对接，得到受体配体结合能（见表3）。结合能表明受体配体的相互作用强度，结合能越低，表明两者结合越稳定。一般认为，结合能<-4.0 kcal·mol-1时，受体与配体之间有较强的结合能力[22]。分子对接结果表明8个核心成分与核心靶点结合能均≤-4.0 kcal·mol-1，这表明本研究中候选Q-Marker与核心靶点之间均有较强的亲和能力，初步验证了指纹图谱和网络药理学的筛选结果。核心靶点CASP8、PRKCA、CASP3、MMP2与较多核心成分有关联，根据受体配体结合能的大小，选取其中结合活性较好的进行可视化分析。详见图8。

3 讨论

中药指纹图谱技术是一种综合、可量化的检测手段，具有整体性和模糊性的特点。指纹图谱具有硬件条件简单，对中药成分的响应较高、稳定性、重复性好及指标成分易检测等优势，TOF/MS等质谱法虽可以检测到较多成分，但是多数成分含量较低，实际应用于中药质量控制在硬件和软件上均有较大难度。网络药理学是基于系统生物学的理论，着重于生物系统的网络分析，在多组分、多靶点和多途径的中药研究中，网络药理学强调整体性和系统性的研究方式与中医药理论高度相似。因此，本研究通过UPLC指纹图谱与网络药理学，筛选得到了苍耳子中8个候选Q-Marker，分别为新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、原儿茶醛、3，4-二咖啡酰奎宁酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸。网络药理学分析得此8个成分主要与苍耳子抗炎、抗病毒和抗肿瘤等作用相关。分子对接展现了此8个成分与关键靶点之间的分子结合力，表明其具有的良好的生物活性。初步确定了以上8种成分可以作为苍耳子的Q-Marker。

文献研究发现，酚酸类成分如原儿茶醛、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸具有抗炎、抗癌、抗血栓和抗氧化活性等[23-27]；咖啡酸在体内外均有显著抗氧化、抗菌活性，并具有调节肠炎的作用[28-30]；1，3-二咖啡酰奎宁酸可通过刺激海马nNOS-NO活性来缓解抑郁症样表型，具有抗抑郁作用[31]；3，4-二咖啡酰奎宁酸对非酒精性脂肪性肝炎具有较好的保护作用[32]；3，5-二咖啡酰奎宁酸可通过调节HMGB1/TLR4/NF-κB通路减轻肝纤维化，并对急性肺损伤具有较好的治疗作用[33-34]；4，5-二咖啡酰奎宁酸可保護肝脏、抗乙肝，并对乳腺癌具有潜在的治疗作用[35]。核心靶点PIK3CA、CASP8、EGFR、PRKCA、CASP3、TLR4、STAT3、ERBB2、MMP2具有较高degree值，可能与苍耳子抗炎、抗菌、抗肿瘤等相关。KEGG富集的主要通路中发现其与新型冠状病毒感染具有较高的关联，其对新型冠状病毒感染的相关药效作用值得进一步研究。苍耳子GO富集分析中生物进程BP主要涉及细胞迁移、蛋白质磷酸化；细胞组分CC主要为质膜、胞质核周区等；分子功能MF主要涉及蛋白质结合、ATP结合等。分子对接验证了其Q-Marker与核心靶点有较好的结合能力，理论上证实了Q-Marker具有较好的生物活性。

中药进入机体发挥作用是个相对复杂的过程，需经炮制、胃肠吸收、肝药酶代谢等多个途径入血发挥药效作用，其中化学成分经各级影响最后才能形成药效分子。从中药指纹图谱与网络药理学分析筛选中药质量标志物具有一定的科学性，其均具有整体性的特点。综上所述，本研究采用指纹图谱结合网络药理学的方式，初步筛选预测出新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、原儿茶醛、3，4-二咖啡酰奎宁酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸为苍耳子的候选Q-Marker，实验为苍耳子质量控制及其作用机制研究提供了一定的参考，也为后续进一步预测和验证苍耳子质量标志物提供了基础。

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〔收稿日期〕2022-09-19

〔基金項目〕安徽省徽派炮制传承工作室项目（皖中医药发展秘〔2021〕10号）；2019年度浙江省重点建设高校优势特色学科（中药学）开放基金资助项目（ZYAOXZD2019005）。

〔第一作者〕敖慧豪，男，硕士研究生，研究方向：中药炮制及质量控制研究。

〔通信作者〕*韩燕全，男，博士，主任药师，E-mail：hyquan2003@163.com。