根际促生细菌对甘薯苗期生长的影响及其促生机制

张玉琴　胡静　尉继强　叶全　刘刚　丁建国　张华德　王同勇　朱海波

关键词：根际促生细菌：甘薯：幼苗生长；连作障碍：溶磷作用

中图分类号：S531.01 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2023） 03-0051-07

甘薯（Ipomoea batatas L.）是我国重要的粮食、饲料以及工业原料作物之一，也逐渐成为一种新型能源作物，其产量的稳步增长对相关产业发展具有重大意义。然而，由于多种原因，山东丘陵地区的甘薯产量往往较低，其中，最重要因素为多年连作导致的土壤肥力下降、土传病害频发等。Ali等研究表明，不适当的耕作制度会进一步加剧土壤肥力问题，导致土壤过度冲刷、养分淋失以及土壤结构破坏。而向土壤中添加特定有益微生物类群，能够有效改善寄主根际微生态环境，提高山地土壤质量，有望实现甘薯的优质高产。

国内外研究表明，有益微生物能够直接调控植物生长发育过程中的激素代谢、基因表达以及功能酶活性，同时改善寄主根际的微生态环境，提高其抵抗生物与非生物胁迫的能力，有效增加作物产量。根据微生物存在部位以及与寄主的互作形式，微生物被分为叶围微生物、根际微生物、内生菌三大类。相比于内生性微生物，根际微生物可以有效定殖于土壤生态位点，对于解决土壤带来的栽培生产问题有着极佳效果。目前，有关根际有益微生物促进甘薯增产提质的研究较少，且相关研究一般局限于固氮细菌、溶磷细菌以及丛枝菌根真菌的作用。解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefacens）与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是农业生产中最常见的根际有益细菌，可以提高土壤酶活性，协调土壤养分，诱导寄主植物相关抗病促生基因（PR1 a/c、H1N1、ctd1、ERF2等）表达，在促进寄主作物生长以及病害防治方面具有广泛应用。本研究以分离自多年连作太子参健康土壤中的解淀粉芽孢杆菌C05与枯草芽孢杆菌G03为对象，利用体外平板试验对其促生能力进行分析评价，并以甘薯为供试作物研究这两株根际细菌对其幼苗生长前期的促生作用，分析两株根际细菌对土壤理化性质、土壤主要酶活性以及甘薯主要抗病促生基因的调控表现，以期为C05与G03在甘薯上的进一步应用提供理论依据与技术支持。

1材料与方法

1.1试验材料

试验于2022年在青岛市中国农业科学院烟草研究所进行。供试甘薯品种为烟薯25。供试根际微生物分离菌株解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefacens）C05与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）G03从多年连作太子参的健康土壤中分离得到，其对植物根系具有一定亲和性，田间存活率高。

1.2根际细菌分离株的体外促生指标测定

1.2.1产铁载体能力测 定将解淀粉芽孢杆菌C05（下文简称C05）与枯草芽孢杆菌G03（下文简称G03）的菌液（OD₆₀₀=0.5，10μL）接种于CAS琼脂培养基上，于28℃恒温培养96 h。培养结束后，测定平板中橙色区域以及菌落直径，计算铁载体产生指数（SPI）。计算公式如下：

SPI=（橙色区域+菌落直径）／菌落直径。

1.2.2无机磷酸盐溶解能力测定 将C05与G03（OD600=0.5，10μL）接种于含0.5%磷酸三钙的Pikovskaya（PVK）琼脂培养基中，于28℃培养7d。培养结束后，通过计算溶解指数（SI）来定量评价分离株溶解无机磷酸盐能力。计算公式如下：

SI=（透明光晕+菌落直径）／菌落直径。

1.2.3产蛋白酶活性测定 将C05与G03（OD60=0.5，10μL）接种于含1%脱脂奶粉的CYE琼脂平板上，于28℃恒温培养Sd。培养结束后，计算产蛋白酶活性指数（PAI），进而定量评价两株根际细菌产蛋白酶活性能力。计算公式如下：

PAI=（透明区域+菌落直径）／菌落直径。

1.2.4合成生长素（IAA）能力测定 将20μLC05与G03细菌悬浮液（OD600= 0.5）接种于含10mmol/L色氨酸的20 mL LB培养基中，并于28μ、150 r/min条件下孵育72 h。培养结束后，取1mL培养上清液（6000×g，10min）与100 mL正磷酸（10mmol/L）、2mL Salkowski试剂混合，在室温下充分反应20 min，随后于530 nm波长下测定吸光度，并通过标准曲线法进行绝对定量。

1.3盆栽促生试验设计及有关指标测定

选择甘薯作为寄主植物在温室中进行盆栽促生试验。栽培盆规格：底径9.5cm，上口径14.0cm，高11.2cm。盆中土壤取自青岛市即墨区鳌山卫镇孙家白庙村田间，其基础理化性质：有机质8.5 mg/g、总氮1.2 mg/g、硝态氮8.7μg/g、铵态氮7.9μg/g、速效磷27.0μg/g、速效鉀105.7μg/g，电导率218.6μS/cm，pH值6.5。于4月20日每盆栽种3株。

试验设计：将C05与G03接种于LB液体培养基中，28℃、150 r/min条件下培养48 h，之后离心（5000×g，5 min），收集菌体并重新溶解于无菌蒸馏水中得细菌悬浮液。将40 mL细菌悬浮液（OD₆₀₀=0.5）于4月30日接种在甘薯幼苗（苗龄20天）根际，对照加入等量水（CK）。在整个试验期间，保证充足水分供应，养护温度为25～28℃，相对湿度为70%，光照循环为12 h。

接菌后10、20 d进行甘薯农艺性状（主蔓长、有效叶数、最大叶面积）调查，并收取甘薯茎叶、根系、土壤样品，测定地上部鲜重与干重、地下部鲜重与干重、叶片叶绿素含量，土壤主要酶活性、理化性质由江苏博研生物科技有限公司测定。每处理60株甘薯，重复3次。

1.4基因相对表达量测定

利用RNA提取试剂盒Plant Total RNA Kit（北京庄盟生物）提取叶片总RNA，借助琼脂糖凝胶电泳检测RNA浓度与完整性，并利用反转录酶HiScript Ⅲ RT SuperMix（南京诺唯赞）将RNA反转录为cDNA，进行基因相对表达量的测定。扩增体系包括：DNA 1.0μL、SYBR qPCR Master Mix10.0μL，上、下游引物各0.4μL，无菌水补足20μL。采用2^-△△Ct法计算基因PR1 a/c、HIN1、ctd1与ERF2的相对表达量。

1.5数据统计与分析

采用Microsoft Excel与Origin软件处理数据和作图，采用SPSS 20.0软件Duncans法进行差异显著性分析。

2结果与分析

2.1根际细菌体外促生能力分析评价

由平板试验结果（表1）可以看出，解淀粉芽孢杆菌C05与枯草芽孢杆菌G03均具有无机磷酸盐增溶作用，SI值分别为4.46、2.97，表明C05溶解磷酸三钙能力显著强于G03。两株根际细菌都具有产铁载体与蛋白酶的能力，与溶磷作用类似，C05能力更强。C05产IAA浓度为49.72μg/mL，显著高于G03（22.37μg/mL）。表明相对于G03，C05具有更高的促生潜力。

2.2盆栽甘薯根际细菌的促生效果与评价

如表2所示，与CK相比，根际接种解淀粉芽孢杆菌C05与枯草芽孢杆菌G03后20 d，薯苗主蔓长、最大叶面积、地上部鲜重和干重、地下部干重和叶片叶绿素a、b含量均显著提高，以C05的促生效果最为显著。10 d时，接种C05与G03的薯苗地下部鲜重与CK无显著差异，20 d时接种C05的地下部鲜重显著高于CK，这表明C05对甘薯块茎生长有较大促进作用，但这种作用是缓慢推进。甘薯幼苗叶片中叶绿素a、b含量存在显著差异，表明C05与G03能够通过改善叶片的光合作用来促进甘薯生长发育。

2.3根际細菌对土壤理化性质的影响

与CK相比，接种解淀粉芽孢杆菌C05与枯草芽孢杆菌G03后盆栽甘薯土壤的总氮、硝态氮、铵态氮、有机质、速效磷、速效钾含量均显著提高，而土壤电导率与pH值无显著差异（表3）。其中，20 d时，接种C05土壤总氮（2.35mg/g）、硝态氮（23.17μg/g）、铵态氮（25.77μg/g）、有机质（25.76mg/g）、速效磷（43.97μg/g）、速效钾（225.3μg/g）含量均最高。表明，接种C05与G03可以改善土壤主要理化性质，促进总氮、硝态氮、铵态氮等氮素释放，利于甘薯幼苗快速生长。

2.4根际细菌对土壤酶活性的影响

由图1A看出，根际接种两株细菌均能显著提高土壤脲酶活性，最优处理为C05，10、20 d时较CK分别增加56.33%、121.77%，3个处理间差异显著。土壤蔗糖酶可以将蔗糖水解成相应单糖而被植物体吸收，其酶促作用产物与土壤有机质、氮、磷含量息息相关。如图1B所示，10 d时，接种C05与G03的土壤蔗糖酶活性均显著高于CK，20 d时C05土壤蔗糖酶活性（604 U/g）进一步提高，且显著高于G03（437 U/g）与CK（264U/g），与CK相比，10、20 d时接种C05与G03的土壤酸性磷酸酶活性均显著提升（图1C）。过氧化氢酶是土壤微生物代谢的重要酶类，在H202清除系统中发挥着重要作用，与土壤有机质含量、土壤肥力因子密切相关。接种C05与G03的土壤过氧化氢酶活性显著增强，20 d时C05该酶活性为CK的2.28倍（图1D）。表明，甘薯根际接种C05与G03后土壤脲酶、蔗糖酶、酸性磷酸酶、过氧化氢酶活性均显著增强，可以更加快速地水解转化土壤中的主要营养成分，提高土壤肥力。

2.5根际细菌对甘薯叶片主要抗病、生长基因表达的影响

如图2所示，接种解淀粉芽孢杆菌C05与枯草芽孢杆菌G03对甘薯叶片抗病基因PR1 a/c表达量没有显著影响，但可以显著激活H1N1基因的表达，有利于提高甘薯幼苗的系统抗性，促进其健康生长。与CK相比，接种C05、G03均显著提高叶片促生基因ctd1、ERF2的相对表达量，其中，20 d时C05对两个促生基因的激活达到最大值。说明，根际接种C05与G03之后，甘薯叶片中特定的抗病基因、促生基因可以被充分激活，为幼苗前期快速生长提供必要保障。

2.6土壤理化性质与土壤酶活性的相关性分析

为了确定土壤理化性质与土壤酶活性之间的内在联系，对两者的主要指标进行相关性分析，结果如图3所示。接菌后10 d时土壤总氮含量与铵态氮、速效磷、速效钾含量呈显著正相关（P<0.05，下同）；土壤硝态氮含量与土壤脲酶活性呈显著正相关，这一相关性与土壤脲酶作用有关，因为土壤脲酶可以水解尿素，产生氨与碳酸，而土壤脲酶活性完全可以反映土壤氮素状况；土壤有机质含量与土壤过氧化氢酶活性呈显著正相关，表明土壤有机质含量的提高，与土壤微生物代谢密切相关（图3A）。

如图3B所示，接菌后20 d时土壤脲酶、蔗糖酶、酸性磷酸酶活性与pH值呈显著正相关，表明土壤特定微生物代谢的改变，可以影响土壤主要酶活性，进而有利于酸化土壤的改良；土壤硝态氮含量与脲酶、蔗糖酶、过氧化氢酶活性，土壤氨态氮含量与过氧化氢酶活性均表现出显著正相关关系。表明，土壤理化性质的变化主要由土壤酶活性转变所引起，而土壤酶活性高低又与土壤微生物群落结构与演变密不可分。

3讨论与结论

本研究通过平板试验分析了分离自连作太子参土壤的解淀粉芽孢杆菌C05与枯草芽孢杆菌G03的体外促生能力。首先，两株根际细菌均具有优异的转化无机磷酸盐能力，这与前人研究得出的其能高效持续地为寄主提供可溶性磷元素、促进植物生长发育的结论一致。根际有益细菌另一种关键营养获取方式主要依靠铁载体进行，铁载体是由微生物产生的铁螯合化合物，可有效减少植物缺铁现象的出现。除了为寄主提供螯合铁，根际有益细菌产生的铁载体在植物中还具有多重作用，比如诱导系统抗病性、清除和隔离病原体中的铁进而控制病害发生。而本研究结果表明，C05与G03都可以产生铁载体。生长素是一类重要的植物激素，能够调节植物发育和生长。根际有益细菌可以产生一种自然形式的生长素IAA，其在细胞增殖中发挥作用，促进植物根系、茎叶的伸长。本研究发现两株根际细菌菌株都能够从色氨酸合成IAA，进而显著促进寄主植物生长，而这一发现与前人研究结论一致。因此，甘薯幼苗主要农艺性状的改善可能得益于两株根际细菌产生的IAA。除了促进宿主生长外，IAA还与植物的多种发育过程有关，比如顶端优势、向地性感应、繁殖等，这使得IAA成为最关键的植物激素之一。

盆栽试验结果表明，甘薯幼苗根际接种C05与G03细菌后，主蔓长、最大叶面积、地上部鲜重和干重、地下部干重和叶片叶绿素a、b含量均显著提升，从而有效促进植株前期生长，利于培育壮苗。为了验证这两株根际有益细菌对土壤的改良效果，测定了盆栽甘薯土壤的主要理化性质，结果显示，C05与G03均可以促进总氮、硝态氮、铵态氮释放，改善土壤营养结构，进而提高连作土壤的可耕作性。相较于CK，接种根际细菌土壤脲酶、蔗糖酶、酸性磷酸酶、过氧化氢酶活性均增强，土壤养分供给有所提高。本研究中，接种C05与G03甘薯叶片的抗病基因H1N1和促生基因ctd1、ERF2表达量均显著升高，表明两株根际细菌可以诱导植株体内相关基因的表达，增强甘薯自身免疫，促进其健康生长发育。而相关性热图结果显示，多个土壤理化指标与土壤酶活性表现出显著正相关关系，这可能与土壤微生物类群的特定演变有关。

综上看出，分离自连作太子参土壤的解淀粉芽孢杆菌C05与枯草芽孢杆菌G03具有体外促生能力，对甘薯幼苗有促生作用，可有效改善土壤营养构成，提高土壤主要酶的活性，诱导甘薯抗病、促生基因的表达，增强寄主系统抗病性。利用植物根际细菌是绿色环保的生物防治方式，加大根际有益细菌的鉴定挖掘，可为微生物菌肥的开发利用提供更优质的种质资源。