逍遥散对雷公藤多苷致胃黏膜损伤大鼠TNF-α、IL-1β、NF-κB P65表达的影响

李媛媛 张碧涛 李红红 崔子龙 王少贤 李振彬

【摘 要】目的：研究逍遙散对雷公藤多苷致大鼠胃黏膜损伤的治疗效果及机制。方法：将24只SD大鼠随机分为空白对照组、雷公藤多苷组、逍遥散组，每组8只。雷公藤多苷组和逍遥散组通过灌胃雷公藤多苷混悬液（0.037 5 g·kg-1）制备胃黏膜损伤模型大鼠，逍遥散组在灌服雷公藤多苷混悬液1 h前灌服逍遥散水煎液（19.27 g·kg-1），给药每日1次，持续5周。观测各组大鼠体质量、摄食量；采用苏木素-伊红染色法（HE）观察各组大鼠胃黏膜病理变化；酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平变化；免疫组化、实时荧光定量PCR法（qRT-PCR）和蛋白质印迹法（WB）检测胃黏膜IL-1β、TNF-α、核转录因子-κB P65（NF-κB P65）蛋白和基因表达。结果：胃黏膜损伤模型大鼠体质量及摄食量明显低于正常大鼠，胃黏膜细胞排列紊乱，腺上皮萎缩呈囊状，黏膜层变薄，毛细血管充血明显，细胞发生水肿现象，肠上皮化生明显，黏膜固有层内有大量中性粒细胞浸润，核分裂多见，核大深染，异型性明显，细胞增生、细胞凋亡与坏死明显，血清中IL-1β、TNF-α含量升高（P < 0.05），胃黏膜IL-1β、TNF-α、NF-κB P65蛋白与基因表达增加（P < 0.05）。逍遥散干预后，大鼠体质量及摄食量增加，大鼠胃黏膜病理形态有不同程度减轻，血清中IL-1β、TNF-α含量降低（P < 0.05），胃黏膜IL-1β、TNF-α、NF-κB P65蛋白与基因表达降低（P < 0.05）。结论：逍遥散可在一定程度上缓解雷公藤多苷所致胃黏膜损伤，其机制可能与调节IL-1β、TNF-α、NF-κB P65的异常表达、减轻炎症级联反应有关。

【关键词】 逍遥散；雷公藤多苷；胃黏膜损伤；炎症因子；核转录因子-κB P65；大鼠

【ABSTRACT】Objective：To study the therapeutic effect and mechanism of Xiaoyao San（逍遥散）on gastric injury induced by tripterygium glycosides in rats.Methods：Twenty-four SD rats were randomly divided into a blank control group，a tripterygium glycosides group and and a Xiaoyao San group，with eight rats in each group.Gastric mucosal injury model rats were prepared by gavage of tripterygium glycosides suspension（0.037 5 g·kg-1）in the tripterygium glycosides group and the Xiaoyao San group.The Xiaoyao San group was given gavage of Xiaoyao San decoction（19.27 g·kg-1）once a day for five weeks one hour before gavage of tripterygium glycosides suspension.Observe the body mass and food intake of rats in each group.The pathological changes of gastric mucosa were observed by hematoxylin-eosin staining（HE）.Detection of the level change of IL-1β and TNF-α was done by ELISA.Immunohistochemistry，qRT-PCR and WB were used to observe IL-1β，TNF-α，NF-κB P65 protein and gene expression in gastric mucosa.Results：The body mass and food intake of gastric mucosal injury model rats were significantly lower than those of the normal rats.The gastric mucosal cells were arranged in disorder，the glandular epithelium was atrophic and cystic，the mucosal layer became thinner，the capillaries were obviously congested，the cells were edema，the intestinal epithelial metaplasia was obvious，there were a large amount of neutrophils infiltration in the lamina propria of the mucosa，mitosis was common，the nuclei were deeply stained，the heteromorphism was obvious，cell proliferation，apoptosis and necrosis were obvious，and the content of IL-1β and TNF-α in serum increased（P < 0.05）.IL-1β，TNF-α，NF- κB P65 protein and gene expression in gastric mucosa increased（P < 0.05）.After the intervention of Xiaoyao San，the body mass and food intake of rats increased，the pathological morphology of gastric mucosa of rats decreased to various degrees，and the content of IL-1β and TNF-α in serum decreased（P < 0.05）.IL-1β，TNF- α，NF-κB P65 protein and gene expression in gastric mucosa decreased（P < 0.05）.Conclusion：Xiaoyao San can alleviate the gastric injury caused by tripterygium glycosides to a certain extent，and its mechanism may be related to the regulation of the abnormal expressions of IL-1β，TNF-α and NF-κB P65 and the reduction of inflammatory cascade reaction.

【Keywords】 Xiaoyao San（逍遥散）;tripterygium glycosides;gastric mucosa injury;inflammatory factors;NF-κB P65;rats

雷公藤为卫矛科植物雷公藤的干燥根或根的木质部，雷公藤多苷是从雷公藤中提取而来的脂溶性混合物，具有抗炎、抗菌、止痛、免疫抑制、抗肿瘤等作用［1-2］，为国内应用最多的免疫抑制剂之一，治疗类风湿关节炎、肾病综合征等自身免疫性疾病效果显著。由于雷公藤多苷毒性成分亦为其有效成分，已成为目前不良反应报道最多的中药成分之一［3］。雷公藤多苷的不良反应发生率约为58.1%，其中胃肠道不良反应发生率约为25.2%［4］。目前，有关雷公藤多苷所致生殖系统毒性、肝毒性、肾毒性研究非常深入广泛，而对其引发胃肠道不良反应机制和有效防治方面的研究尚显不足［5-7］。临床常通过改变剂型以减少雷公藤多苷对胃肠道的刺激［8］，或与甲氨蝶呤、来氟米特、依那西普等西药配伍对抗胃肠道反应［9-10］，以期达到减毒增效作用，但应用比较局限。众多研究提示，中医药防治雷公藤致胃肠损伤具有安全、有效、耐受性好的特点，中药复方可通过多途径、多靶点干预雷公藤的不良反应［11］。

逍遥散（宋·《太平惠民和剂局方》）为疏肝健脾的主要中药复方，学者多关注逍遥散对雷公藤所致急性肝损伤的保护作用［12］，而对其缓解胃黏膜损伤机制研究不足。本研究以雷公藤多苷灌胃5周致大鼠胃黏膜损伤，逍遥散作为干预用药，采用苏木素-伊红染色法（HE）观察大鼠胃黏膜病理形态学变化，采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测大鼠血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）水平变化，免疫组化、实时荧光定量PCR法（qRT-PCR）和蛋白质印迹法（WB）检测大鼠胃黏膜TNF-α、IL-1β和核转录因子-κB P65（NF-κB P65）蛋白和基因表达，旨在探讨逍遥散防治雷公藤多苷致胃黏膜损伤的效应及机制。

1 实验材料

1.1 实验动物 清洁級SD雄性大鼠24只，6周龄，体质量180～200 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物生产许可证号SCXK（京）2016-0006。标准动物房饲养，实验动物使用许可证号SYXK（冀）2017-005。本实验符合河北中医学院伦理委员会对实验动物的相关伦理要求（伦理审查报告编号DWLL2018033）。

1.2 实验药品 逍遥散（柴胡30 g、白芍30 g、当归30 g、白术30 g、茯苓30 g、薄荷10 g、煨姜10 g、炙甘草15 g；生药饮片均购自北京同仁堂饮片有限责任公司，批号分别为050190901，015190901，A190028001，20190602，20191001，20191224，20190111，20190514）；雷公藤多苷购自南京泽朗生物科技有限公司（批号ZL20181229）。

1.3 主要试剂和仪器 苏木精-伊红染色试剂（批号BA-4097，珠海贝索生物技术有限公司）；大鼠IL-1β ELISA试剂盒（批号ab100767，Abcam）；大鼠TNF-α ELISA试剂盒（批号ab46070，Abcam）；免疫组化试剂盒（批号PK-4001，Vector）；Eastep Super总RNA提取试剂盒（批号LS1040，上海普洛麦格生物产品有限公司）；GoScript 逆转录系统（批号A2801，Promega）；GoTaq qPCR反应混合物（批号A6001，Promega）；IL-1β单克隆抗体（批号ab9722，Abcam）；TNF-α单克隆抗体（批号ab6671，Abcam）；NF-κB P65单克隆抗体（批号ab16502，Abcam）；TNF-α多克隆抗体（批号ARC3012，Invitrogen）；IL-1β多克隆抗体（批号P420B，Invitrogen）；NF-κB P65多克隆抗体（5G6）（批号YM3111，Immunoway）；GAPDH 小鼠单克隆抗体（批号10013030，Proteintech）；IRDye 800CW 山羊抗小鼠 IgG（H + L）（批号926-32210，LI-COR）；IRDye 800CW 山羊抗兔IgG（H + L）（批号926-32211，LI-COR）。

台式高速冷冻离心机（型号3K15，SIGMA）；石蜡切片机（型号RM2245，Leica）；酶标仪（型号384Plus，上海美谷分子仪器有限公司）；显微镜（型号BX53，OLYMPUS）；手持电动匀浆器（型号T10，IKA）；实时荧光定量PCR仪（型号CFX96，Bio-Rad）；Mini-PROTEAN Tetra小型垂直电泳槽、Mini Trans-Blot Cell小型转印槽（型号1658004、1703810，BIO-RAD）；双色红外激光成像系统（型号ODYSSEY CLx，LI-COR）。

2 实验方法

2.1 分组及给药 24只大鼠适应性喂养1周后，随机分为空白对照组、雷公藤多苷组、逍遥散组，每组8只。空白对照组每日灌胃生理盐水。雷公藤多苷组每日灌胃雷公藤多苷［13］，以0.037 5 g·kg-1体质量给药（根据临床用药量按体质量折算系数6.25，正常人最大用药量0.001 5 g·kg-1·d-1进行计算，4倍量用药）。逍遥散组每日灌胃逍遥散水煎液，参照文献［14-15］，用药量19.27 g·kg-1·d-1；1 h后灌服雷公藤多苷。3组均连续给药5周。

2.2 样品制备及指标检测 给药结束，水合氯醛麻醉，股动脉取血，低温高速离心机以2000 r·min-1离心，离心半径7 cm，取血清置于-80 ℃冰箱备用；取大鼠胃窦组织，1/2放于中性甲醛中固定，制备蜡块，剩余1/2置于冻存管中，放入液氮速冻，存放于-80 ℃冰箱备用。

2.2.1 体质量 于实验第0，7，14，21，28，35天称量并记录大鼠体质量。

2.2.2 摄食量 2只大鼠一笼，每组分为4笼，实验前1 d给予定量食物，24 h后记录剩余食量，分别于实验第0，7，14，21，28，35天测定并记录每笼大鼠平均摄食量数据［平均摄食量 = （给食量-剩余食量）/大鼠只数］。

2.2.3 胃黏膜病理形态学变化 常规HE染色法染色，将组织置于质量分数为10%中性甲醛溶液固定后，脱水，石蜡包埋，切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，苏木素染色，水洗，盐酸乙醇分化，水洗蓝化，伊红染色，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光学显微镜观察。

2.2.4 血清TNF-α、IL-1β水平测定 采用酶联免疫吸附（ELISA）法检测各组大鼠血清TNF-α、IL-1β水平，严格按照试剂盒说明进行操作。

2.2.5 胃黏膜TNF-α、IL-1β、NF-κB P65阳性表达 每组选取5只大鼠，每只取部分胃窦组织做石蜡包埋切片，梯度脱蜡、水化，柠檬酸钠缓冲液修复，质量分数为3%的H2O2浸泡以消除内源性过氧化物酶，羊血清封闭，加入稀释一抗（TNF-α 1∶50，IL-1β 1∶150，NF-κB P65 1∶75），4 ℃湿盒孵育过夜；PBS洗片3次，滴加稀释的二抗（1∶200），37 ℃孵育；PBS洗涤3次，DAB显色剂显色，苏木精染色，盐酸乙醇分化，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树脂封片，干燥。光学显微镜下观察，每只大鼠胃窦组织拍摄2张，每组选取10个不同视野拍照，采用Image-Pro Plus 6.0进行阳性细胞表达数及总积分光密度（IOD）值分析。

2.2.6 胃黏膜TNF-α、IL-1β、NF-κB P65 mRNA测定 采用Eastep Super总RNA提取试剂盒提取总RNA，根据GoScript逆转录系统操作说明进行逆转录合成cDNA，根据Go Taq qPCR 反应混合物说明进行操作，于50 μL反应体系中，以2 μL cDNA为模板进行PCR扩增。扩增结束后，得到各样本各目的基因及内参基因GAPDH的Cq值，目的基因Cq值 - 内参基因GAPDH的Cq值 = ΔCq，根据公式Q = 2-ΔCq，得到每个目的基因的Q值及Q均值，再以每个目的基因的Q值/Q均值，即目的基因表达的相对定量值（RQ值），将RQ值用于统计分析。引物序列见表1。

2.2.7 胃黏膜IL-1β、TNF-α、NF-κB P65蛋白测定 每组选取3只大鼠，取组织约100 mg，提取蛋白，经典BCA法进行总蛋白浓度测定，蛋白变性后取150 μg进行SDS-PAGE电泳，NC膜上转膜，4 ℃冰箱内脱脂奶粉封闭过夜，加一抗（GAPDH 1∶20 000，NF-κB P65 1∶1000，IL-1β 1∶600，TNF-α 1∶500），4 ℃冰箱过夜。洗涤后加荧光二抗（1∶10 000），摇床常温孵育1 h。洗膜后，湿润状态下将膜放入双色红外激光扫描成像系统进行成像。使用双色红外激光扫描成像仪器自带图像分析系统进行目的条带IOD值收集，以目标蛋白IOD/内参IOD公式计算IL-1β、TNF-α、NF-κB P65的蛋白相对表达量，并进行统计分析。

2.3 统计学方法 采用SPSS 21.0软件进行统计分析。计量资料以表示，体质量、摄食量采用一般线性模型的重复测量方法进行单变量方差分析，多因素方差分析进行每一时间点上的组间两两比较（SNK-q法）。其余资料，符合正态分布采用单因素方差分析，方差齐采用SNK-q法，方差不齐采用秩和检验；不符合正态分布采用非参数检验。以 P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 各组大鼠体质量比较 实验第0，7天各组大鼠体质量比较，差异无统计学意义（P > 0.05）；与空白对照组比较，实验第14，21，28天雷公藤多苷组及逍遥散组大鼠体质量增长缓慢（P < 0.05）；与雷公藤多苷组比较，实验第28，35天逍遥散组大鼠体质量增加，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表2。

3.2 各组大鼠摄食量比较 实验第0，14，21，28天各組大鼠摄食量比较，差异无统计学意义（P > 0.05）；用药后，雷公藤多苷组大鼠摄食量较空白对照组减少，尤其在实验第7，35天，差异有统计学意义（P < 0.05）；与雷公藤多苷组比较，逍遥散组大鼠摄食量均有增加趋势，尤其在实验第7，35天，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表3。

3.3 各组大鼠胃黏膜病理结果 空白对照组大鼠胃黏膜细胞腺上皮排列整齐，无毛细血管充血、水肿，未见肠上皮化生现象，黏膜固有层未见炎细胞或有少量炎细胞存在；雷公藤多苷组大鼠细胞排列紊乱，腺上皮萎缩呈囊状，黏膜层变薄，毛细血管充血明显，细胞发生水肿现象，肠上皮化生明显，黏膜固有层内有大量中性粒细胞浸润，核分裂多见，核大深染，异型性明显，细胞增生、细胞凋亡与坏死明显；逍遥散组大鼠胃黏膜病理形态有不同程度减轻。见图1。

3.4 各组大鼠血清IL-1β、TNF-α含量比较 与空白对照组比较，雷公藤多苷组、逍遥散组大鼠血清中IL-1β、TNF-α含量升高（P < 0.05）；与雷公藤多苷组比较，逍遥散组大鼠血清中IL-1β、TNF-α含量降低（P < 0.05）。见表4。

3.5 各组大鼠胃黏膜IL-1β、TNF-α、NF-κB P65表达 与空白对照组比较，雷公藤多苷组、逍遥散组大鼠胃黏膜IL-1β、TNF-α、NF-κB P65阳性细胞数及IOD值增加（P < 0.05）；与雷公藤多苷组比较，逍遥散组大鼠胃黏膜IL-1β、TNF-α、NF-κB P65阳性细胞数及IOD值降低（P < 0.05）。见图2、表5、表6。

3.6 各组大鼠胃黏膜IL-1β、TNF-α、NF-κB P65 mRNA表达比较 与空白对照组比较，雷公藤多苷组、逍遥散组大鼠胃黏膜IL-1β mRNA表达增加（P < 0.05），雷公藤多苷组TNF-α、NF-κB P65 mRNA表达增加（P < 0.05）；与雷公藤多苷组比较，逍遥散组大鼠胃黏膜IL-1β、TNF-α、NF-κB P65 mRNA表达均降低（P < 0.05）。见表7。

3.7 各组大鼠胃黏膜IL-1β、TNF-α、NF-κB P65蛋白表达比较 与空白对照组比较，雷公藤多苷组大鼠胃黏膜IL-1β、TNF-α、NF-κB P65蛋白表达增加（P < 0.05）；与雷公藤多苷组比较，逍遥散组大鼠胃黏膜IL-1β、TNF-α、NF-κB P65蛋白表达均降低（P < 0.05）。见图3、表8。

4 讨 论

本实验雷公藤多苷组大鼠胃黏膜病理可见腺上皮萎缩，毛细血管扩张充血，肠上皮化生明显，黏膜固有层内有大量炎症细胞浸润，与文献［16］一致，说明连续5周灌服4倍量雷公藤多苷可制备明显的胃黏膜损伤大鼠模型。

IL-1β、TNF-α等致炎因子持续存在并且损伤组织是发生慢性炎症的根本原因。现代研究发现，IL-1β、TNF-α的过度表达与胃部炎症反应呈正相关，其表达程度可反映胃部损伤程度及恢复程度［17］。NF-κB是广泛存在于人体各种组织中的核转录因子，能够诱导下游促炎基因的表达［18］，与机体的生理病理密切相关［19］。生理情况下，NF-κB多以P65及P50构成的异二聚体存在于细胞质中，以非活性形式存在。当受到外来药物，尤其是毒性药物时，会激活胃黏膜中NF-κB，使其由细胞质转移到细胞核，从而易与IL-1β、TNF-α等多种炎症因子启动子区域κB序列结合，通过调控炎症因子的转录、表达而引发胃黏膜的炎性反应［20］，使胃肠反应加重，而炎症因子IL-1β、TNF-α的过度表达又可进一步促进NF-κB活化。如此循环，产生级联效应，使胃部炎性反应持续加重，胃肠道反应愈发严重。其中，NF-κB P65可以直接激活基因转录，其活化水平可以代表NF-κB的激活程度［21］。成映霞等［16］报道慢性萎缩性胃炎模型大鼠胃损伤和NF-κB P65与IL-1β、TNF-α之间的炎症级联反应密切相关，李贵生等［22］报道在顺铂导致的大鼠胃肠损伤模型中可见NF-κB P65与IL-1β、TNF-α异常表达。

本实验雷公藤多苷组大鼠胃黏膜病理损伤明显，且伴随NF-κB P65蛋白及mRNA显著升高的同时，炎症因子IL-1β、TNF-α表达也同时升高，提示表达异常的NF-κB P65与IL-1β、TNF-α相互间的级联放大加重了胃黏膜损伤［23］。

逍遥散为疏肝健脾名方，临床常用于治疗慢性浅表性胃炎、慢性糜烂性胃炎、慢性萎缩性胃炎、功能性消化不良等疾病，效果明显且不良反应较少［24-25］，其中柴胡疏肝解郁，当归、白芍养血柔肝，共为君药；白术、茯苓健脾祛湿，为臣药；薄荷、煨姜共为佐药，以助疏散调达之力；炙甘草益气补中，缓急止痛，调和诸药［26］。刘群［17］报道，逍遥散可以有效对抗胃部黏膜水肿、充血及慢性炎症病理形态改变。徐嘉蔚等［27］研究显示，逍遥散可以增加肝硬化模型大鼠胃窦平滑肌细胞胃动素、胃窦及空肠平滑肌细胞胃动素受体表达。李晓红等［28］报道可见，逍遥散可通过调节胃肠道中的促肾上腺皮质激素释放激素受体，改善胃肠道功能紊乱，减轻炎症反应。姜瑞池［29］研究显示，逍遥散可通过减轻IL-1β、TNF-α的异常表达治疗慢性胃炎。康乐蔷薇等［30］报道，逍遥散可通过下调促炎因子IL-1β、TNF-α，恢复功能性消化不良肝郁脾虚型模型大鼠的胃肠动力。

本实验结果表明，经逍遥散干预，大鼠体质量、摄食量增加明显，胃黏膜病理形态得到改善，同时NF-κB P65、IL-1β、TNF-α的表达降低，表明逍遥散在一定程度上可改善雷公藤多苷所致胃黏膜损伤，其机制可能与调节NF-κB P65、IL-1β、TNF-α的异常表达有关，通过减轻炎症级联反应从而达到抗雷公藤多苷毒性保护胃黏膜的作用。

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收稿日期：2022-11-06；修回日期：2022-12-29

基金项目：国家自然科学基金项目（81873301，81673881）；中医药创新专项（223777121D）；中医药联合基金培育项目（H2022423375）；河北中医学院2020年研究生创新资助立项项目（XCXZZSS2020017）

作者单位：1.河北中医学院，河北 石家庄 050200；2.中国人民解放军白求恩国际和平医院，河北 石家庄 050000

通信作者：王少贤