MutYH相关息肉病患者的基因变异特点分析*

赵子夜，汪昭明，高显华，尹书怡，郑建明，方瑞华，邢俊杰，王颢，张卫，于恩达△

1 上海长海医院肛肠外科/遗传性结直肠癌筛查防治中心 上海 200433

2 上海长海医院病理科 上海 200433

遗传性结直肠癌综合征是一类具有遗传背景的结直肠癌。目前发现的遗传性结直肠癌均为单基因遗传病。在过去的20年里，医学界对遗传性结直肠癌综合征，尤其是息肉病型遗传性结直肠癌综合征（即结肠息肉病）的认识和理解有了快速而广泛的提高。结肠息肉病可根据息肉的病理性质和数量进行分类。若能明确致病或变异基因，则可获得遗传学诊断。美国胃肠病学会（American College of Gas⁃troenterology，ACG）指南明确了结肠息肉病的7种类型，并提供了具体的诊断和治疗建议。这7中类型分别是家族性腺瘤性息肉病（familial adenomatous pol⁃yposis，FAP）、衰减型家族性腺瘤性息肉病（attenu⁃ated familial adenomatous polyposis，AFAP）、MutYH相关息肉病（MutYH-associated polyposis，MAP）、黑斑息肉综合征（Peutz–Jeghers syndrome，PJS）、幼年性息肉病（juvenile polyposis syndrome，JPS）[1]、PTEN错构瘤肿瘤综合征/Cowden 综合征（PTENHamartoma Tumor Syndrome/Cowden syn⁃drome，PHTS/CS）及锯齿状息肉病综合征（serrat⁃ed polyposis syndrome，SPS）[2]。随着基因检测和分子诊断技术的发展，通过识别遗传学改变对结肠息肉病进行分型已经成为可能并逐渐形成趋势，这对遗传咨询、家系风险评估大有帮助。

结肠腺瘤性息肉病（colorectal adenomatous pol⁃yposis，CAP）是最常见的结肠息肉病类型。MutYH（原名MYH）较早（2002年）被证实为CAP 的致病基因，由Al-Tassan 等[3]在英国威尔士地区的一个CAP家系中发现。此类CAP表型多为AFAP，在明确致病基因后命名为MAP，人类孟德尔遗传在线（https://omim.org/）分类名为 FAP2 型（OMIM 608456），是一种常染色体隐性遗传病。MutYH即mutY homolog，意为大肠杆菌腺嘌呤DNA 糖基化酶的同源基因，是DNA 修复途径——碱基切除修复（base excision repair，BER）的成员之一。碱基切除修复途径的另一个成员——NTHL1，也可导致CAP和结直肠癌[4]。MutYH功能缺失可引起基因组中特异性的G>T颠换[5]，由此可导致病理学及分子生物学方面一系列独特的改变。目前已在MAP 和结直肠癌患者中发现了100 多种MutYH致病性变异（www.lovd.nl/MUTYH），相关病例大部分属于欧美学者报道的高加索人种[6]。MAP 在东亚人群[7]中鲜有报道，其变异特点、临床表现及病理特征尚未得到全面描述。本研究基于本中心MAP 患者的临床资料，分析基因变异及临床病理特征，并部分呈现中国MAP 患者的临床和遗传学特点。

1 资料与方法

1.1 研究对象

上海长海医院遗传性结直肠癌筛查防治中心登记有各类息肉病患者共500 多例。笔者团队于2020年12月对其中166 例CAP 患者进行了结直肠癌相关致病基因胚系突变检测。从医院信息系统（hospital information system，HIS）获取CAP 患者的临床信息和家系信息，并通过随访补充部分信息。患者在住院或随访期间被招募进入CAP 监测及研究计划，其结肠病变石蜡包埋标本保存于长海医院病理科，患者及其亲属的外周血及口腔黏膜标本于随访时获取。所有患者在入院时均签署知情同意书，并授权使用其临床信息及生物标本。此外，在随访期间补充采集的标本也均获得患者及其亲属的知情同意和书面授权。本研究经医院伦理委员会审批通过。

1.2 纳入与排除标准

纳入标准：临床诊断为CAP 的患者且经MutYH胚系变异检测明确为MutYH基因双等位基因变异携带者（纯合变异或复合杂合变异），此类患者亲属若经基因检测证实为相同变异携带者（双等位基因变异）也纳入研究。排除标准：生物样本不能满足检测所需，拒绝参与研究，关键临床信息缺失。

1.3 研究方法

采用动物基因组DNA 提取试剂盒提取生物标本的基因组DNA。采用Sanger 测序、下一代测序（next generation sequencing，NGS）或多重连接探针扩增（multiplex ligation-dependent probe amplifica⁃tion，MLPA）等技术进行MutYH变异检测。NGS 及其涉及的DNA 提取、PCR 扩增等实验内容由上海鉴研生物技术公司完成。Sanger测序及其涉及的MutYH的16 个外显子扩增等实验内容由上海迈浦生物技术公司完成，具体实验方法可参考文献[8]。MutYH的扩增引物及测序引物见表1。

表1 MutYH基因外显子扩增及测序引物

对于NGS 未检出致病变异的CAP 患者（即未发现APC致病变异及MutYH双等位基因变异者），由病理科医师复查病理切片结果，再次确认其临床诊断。非CAP 患者终止试验，确诊为CAP 的患者继续进行APC及MutYH的MLPA 实验。MLPA 实验使用SALSA MLPA Probemix P043 APC 试剂盒，该试剂盒包含MutYH的第1、第2、第11、第16号外显子检测探针。由上海生工生物工程公司完成，具体实验方法可参考文献[9]。使用coffalyser 软件解读结果（www.mlpa.com/coffalyser）。

1.4 临床数据收集及指标分析

本研究将携带MutYH双等位基因变异（复合杂合变异/纯合变异）的患者诊断为MAP，总结其Mu⁃tYH变异及临床表型。根据息肉数量将CAP分为衰减型CAP（息肉数量10～99枚）和经典型CAP（息肉数量≥100 枚），其中经典型CAP 可进一步分为稀疏型CAP（息肉数量100～1 000 枚）和密集型CAP（息肉数量>1 000 枚）。汇总分析患者的息肉/肿瘤病理结果，包括内镜切除标本和手术标本的病理性质、错配修复（mismatch repair，MMR）蛋白表达情况（错配修复功能完整或缺失），以及KRAS基因突变情况。其中，MMR 蛋白完整表达称为错配修复完整（MMR proficient，pMMR），MMR蛋白表达缺失称为错配修复缺陷（MMR deficient，dMMR）。

1.5 统计学方法

使用SPSS 25.0 进行统计分析，计量资料以M（QL，QU）表示；计数资料以[n(%)]表示。

2 结果

2.1 变异检测及致病性分析

在166 例CAP 患者中，10 例患者携带MutYH双等位基因变异，修正诊断为MAP。在这10 例携带MutYH双等位基因变异的患者中，有2例患者属于同一家系（MAP-2），共确认了9 个MAP 家系，见图1（MAP-6/7 无详细家系信息）。仅MAP-5 家系为纯合变异，其余均为复合杂合变异。其中6 个家系（MAP-1/2/3/4/5/7）中的8种变异（c.55C>T、c.799C>T、c.467G>A、 c.1435G>T、 c.733C>T、 c.1187G>A、c.857G>A、c.1214C>T）已被报道，另外5 种变异（c.307T>G、 c.1047G>A、 del exon2、 del exon11、del exon16）在数据库（dbSNP，ClinVar，ExAC，HG⁃MD，LOVD）中未见报道或记录，4种变异（c.55C>T、c.799C>T、c.857G>A、del exon2）在本队列中重复检出（表2）。上述13种变异中，10种为点突变/单核苷酸变异（single nucleotide variant，SNV），3 种为大片段缺失，属于拷贝数变异（copy number varia⁃tion，CNV）。SNV 中的5 种无义变异（c.55C>T、c.467G>A、c.799C>T、c.1047G>A、c.1435G>T）和3种CNV（del exon2、del exon11、del exon16）均可导致MutYH蛋白截短或降解，可直接判定为致病变异。c.1187G>A是最早发现于高加索人种中的始祖变异，且在欧洲MAP 患者中多次检出，可判定为致病变异[10]。另外4 种错义变异（c.307T>G、c.733C>T、c.857G>A、c.1214C>T）会导致单个氨基酸的替换，根据PolyPhen-2工具（http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/）预测均可导致显著的功能改变（图2）。综合人群（不可用）、计算机预测（相同氨基酸改变已被证实为致病变异/PS1）、功能学（不可用）、分离（与MAP表型共分离/PP1）、新发变异（不可用）、其他信息（患者表型高度特异/PP4）等数据分析致病性，根据美国医学遗传学与基因组学学会（Ameri⁃can College of Medical Genetics and Genomics，AC⁃MG）标准[11]最终判定上述4 种错义突变均为可能致病变异（1PS+2PP）。

图1 MAP家系图

表2 先证者所携带的MutYH基因变异

2.2 临床表现

10例MAP患者分属9个独立家系，除MAP-5家系存在近亲结婚且为MutYH纯合变异外，其余8个家系中未发现近亲结婚，致病变异为复合杂合变异（图1）。10例MAP患者中，有6例结肠息肉数量不足100 枚，属于衰减型CAP；其余4 例息肉数量大于100 枚，但不足1 000 枚，属于经典型（稀疏型）CAP（图3A、图3B），病理证实均为腺瘤（图4A、图4B）。1 例患者罹患胃息肉病（MAP-7 1）（图3C）。这10例MAP患者接受治疗时，6例已发生结直肠癌（图3D、图4C），1例发生腺瘤高级别上皮内瘤变（表3）。6例结直肠癌患者中的5例术后标本进行了KRAS基因检测和免疫组化实验，其中4 例为KRAS突变型，2 例为dMMR。10 例患者中，1 例始终采取结肠镜治疗；9 例接受外科手术治疗（其中1人接受两次手术），其中3 例接受全大肠切除术（2例回肠储袋肛管吻合、1例回肠造口术）（图3E、图3F），5例接受全结肠切除术（回肠直肠吻合），1例接受次全大肠切除术（升结肠肛管吻合）。1例患者术后15个月死于结肠癌肝转移（MAP-8 Ⅱ:1）。10例MAP 患者的中位发病年龄为42（27，62）岁，中位治疗年龄为48（31，62）岁。发生癌变的6 例MAP患者中，经典型CAP 和衰减型CAP 各3 例，治疗年龄分别为41 岁、43 岁、58 岁，31 岁、48 岁、62岁。MAP-2 家系中的2 例患者均从42 岁开始内镜监测，癌变者手术时年龄为48 岁，未癌变者手术时年龄为53岁（表3）。

图3 部分MAP患者的内镜图

图4 部分MAP患者的病理结果图

表3 MAP患者的表型特征

表3（续）

3 讨论

根据致病基因的不同，CAP 可分为APC相关息肉病（APC-associated polyposis，AAP）、MAP、AX⁃IN2相关CAP、聚合酶校对相关息肉病（polymerase proofreading associated polyposis，PPAP）及结构性错配修复缺陷综合征（constitutional mismatch re⁃pair deficiency syndrome，CMMRD）[12]。由于临床诊断时通常不能获得基因检测结果，CAP 既往几乎均被诊断为FAP，暗示着APC是最可能的致病基因，其在CAP患者中的检出率为70%～90%。随着CAP患者数量的增加，越来越多的CAP 患者被发现不携带APC基因变异，而发现了其他CAP 相关基因。本研究在166 例CAP 患者中鉴定到10 例MAP 患者，分属9个独立家系。经典型CAP患者4例，衰减型CAP患者6 例。这10 例患者的中位发病年龄为42 岁，平均发病年龄为48 岁，诊断时癌变比例为6/10，均与文献报道相似[13]。MAP患者肿瘤的KRAS突变型比例为4/5，dMMR 也存在（2/5）。在9 个家系18 个MutYH变异中有非重复变异13 种，其中5 种未见于既往报道，且有大片段缺失CNV 3种。既往应用MLPA检测MutYH的CNV仅见于两项研究[14-15]，本研究结果提示该基因CNV 存在的客观性，尤其对于SNV 检测未发现致病变异者，一定要完善CNV 检测以避免得出假阴性结论。

由结肠息肉病综合征导致的结直肠癌仅占1%～3%，且不同CAP 在临床表现上并不存在明确界线而是相互混杂，因此目前无法仅凭临床表现确诊一种CAP，这一情况在无家族史的患者中尤其明显。对MAP 这类隐性遗传病而言，可能引起混杂的因素至少包括以下两个：（1）罕见的跨世代家族史；（2）息肉数量极少以致不能引起医师对CAP 的怀疑。MAP 总体上具有息肉数量较少、发病时间较晚、肠外表现不鲜明的特点，因此现阶段确诊MAP 的时间总体上是落后的，很多患者确诊时已有癌变。在基因诊断方法改进和介入时机恰当选择上进行尝试是提升MAP 诊疗效果的必由之路。同时，结合在散发性结直肠癌中发现MutYH双等位基因变异的事实综合分析，一旦实现早期诊断，极有可能面对MAP 表型进一步复杂化的情况，尤其当面对未生长结肠息肉或息肉数量极少而不能达成CAP 诊断标准时，需要考虑对MAP 进行重新定义，类似于BMPR1A相关息肉病的情况[16]。

MutYH作为一种BER 基因，其蛋白产物可以修复DNA的特定氧化损伤，降低DNA复制过程中的错误概率[17]。因为MutYH有多种转录本及蛋白异构体，所以在识别该基因变异的历程中经历过若干次参考序列的改变，当前参考转录本为NM_001128425，包含氨基酸残基549个，对早期文献报道及数据库记录的变异应注意对序列差异的识别。p.Y179C 和p.G396D在高加索人种MutYH变异中约占80%[6]，被认为是欧洲的“始祖变异”。Aretz等[18]专门对这两个变异的发生时间进行推算，得出这两个变异分别出现于约305世代和350世代之前，即公元前8 000—4 000年的新石器时代。有关MAP的早期文献和部分地区的报告中存在着较高比例的纯合变异患者（6/7和13/13）[19-20]，这与本研究队列显著不同（1/9），其中的重要原因在于我国的计划生育制度很大程度避免了近亲结婚的出现。因为已确诊的MAP 患者数量有限，其基因型—表现型相关性分析较难开展。来自英国加迪夫大学、德国波恩大学和荷兰莱顿大学的数据共汇总了257 例MAP 患者信息用于相关性分析，得到的核心结论是p.Y179C导致临床表现更严重而p.G396D相对较轻，临床现象与体外实验结果一致[21]。但上述结论的意义相对有限，仅能对携带上述“始祖变异”的个体提供预测信息，对其他族群或其他变异携带者并不具有参考价值。再分析肠外表现时病例数增加到了276例，结果发现十二指肠腺瘤最为常见，发生率为17%～34%[22]。本研究仅1例患者在胃镜检查中发现胃息肉病，说明我们在临床实践中对此类患者上消化道的监测较为薄弱。研究数据还提示MAP 患者的膀胱癌、卵巢癌的风险有所增加，值得进一步关注。

隐性遗传病致病变异往往以一定的比例广泛存在于人群中，且具有人群特异性。欧美国家的数据表明，MutYH杂合变异携带者在无症状人群中的比例为1%～2%，按照隐性遗传病发生率粗略计算方法推断，MAP 的自然发生率为（2.5～10）/10 万。MutYH变异杂合携带者虽然不会发展为CAP，但其罹患结直肠癌、胃癌、子宫内膜癌的风险也有所增加[23]。美国、加拿大、澳大利亚的结直肠癌汇总数据表明，结直肠癌患者携带MutYH杂合变异的比例高达1/45[24]，这表明散发以及无息肉病表现的结直肠癌患者中存在着相当数量的MutYH变异携带者，那么Mu⁃tYH变异所导致的特异性病理学及分子生物学特征对于识别此类患者具有重要的价值。目前已经发现MAP 患者除发生结肠腺瘤外，可能同时存在增生性息肉和锯齿状病变（息肉/腺瘤）[25]。锯齿状病变的特点是不经过经典腺瘤癌变途径而发生癌变，可伴随BRAF突变、KRAS突变、微卫星不稳定性等特征。另一方面由于MutYH功能缺失会导致基因组内大量G>T 颠换，导致MAP 相关结直肠癌具有较高比例的KRAS突变发生，也可以导致MMR 基因的变异继而引起dMMR肿瘤的发生。Lynch综合征在结直肠癌中占比约为3%，与此同时，具有dMMR表现却无相应MMR 基因及其相关基因胚系变异的Lynch 样综合征占比也接近3%，其中部分患者可检测到MutYH双等位基因胚系突变[14]。上述现象存在广泛重叠，其深层次原因值得进一步研究。现阶段临床实践中需要注意：（1）加强KRAS突变型结直肠癌患者的MutYH胚系突变检测；（2）dMMR不是排除MutYH胚系突变的标准。

本研究的不足之处主要有以下两点：（1）样本量太小以至于不能进行统计推断。虽然研究呈现出了息肉病表型与癌变比例无显著相关、肿瘤KRAS突变型比例高（4/5）、dMMR比例低（2/5）等与既往研究接近的结果，但不能获得统计推断的佐证。（2）没有进行非息肉病结直肠癌患者的MutYH胚系检测，从而不能进行两组间的对比，不能获得进一步的基因型—表现型数据。以上缺陷值得进一步积累数据或进行多中心研究来获得更可信、更有价值的结果。

利益冲突声明全体作者均声明不存在与本文相关的利益冲突。