依洛尤单抗对急性心肌梗死患者血小板活化及预后的影响分析

曹明英 姚朱华 张伶俐 王永刚

300121 天津市人民医院心内一科(曹明英、姚朱华、张伶俐);300070 天津医科大学研究生院(王永刚)

血小板异常活化在急性冠状动脉综合征发生发展过程中起着关键作用[1],此类患者经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention,PCI)术后即刻血小板CD62p、CD63和糖蛋白(glycoprotein,GP)Ⅱb/Ⅲa水平较术前明显增高[2-3]。PCI术中对狭窄局部实施球囊机械性压迫、撕裂及支架置入,使斑块破裂,暴露出内皮下胶原、血管性血友病因子(von Willebrand factor,vWF)等配体,通过vWF-GPⅠb 介导血小板粘附于损伤表面,引起血小板活化。活化的血小板不仅参与血栓形成,还释放多种血管活性物质、细胞因子和生长因子,参与介入治疗后的急性和亚急性血管再闭塞和再狭窄的发生[4-5]。前蛋白转化酶枯草溶菌素9(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9,PCSK9)是一种丝氨酸蛋白酶,通过促进低密度脂蛋白受体在核内体和溶酶体中的降解,增加血液中低密度脂蛋白胆固醇的水平,在脂质代谢中起着重要作用[6]。最近研究也有报道PCSK9在心血管事件中发挥的作用与调节低密度脂蛋白胆固醇外作用相关,包括它在促进血小板活化和凝血过程中的作用,从而使心血管疾病进展[7-9]。研究显示,高PCSK9水平与接受直接PCI的急性心肌梗死患者的心脏事件独立相关,其原因可能是PCSK9与患者的炎症和血小板活化标志物有较强的相关性[10-11]。由此,PCSK9抑制剂(PCSK9 inhibitors,PCSK9i)因在预防和治疗心血管疾病中的多效性而备受关注,不过迄今为止,以上结果仅限于动物实验或少数临床研究。本研究旨在观察PCSK9i(依洛尤单抗)对急性心肌梗死患者血小板活化的影响及对患者预后的影响。

1 对象和方法

1.1 研究对象

前瞻性队列研究。入选2019年12月至2021年12月在天津市人民医院心内科住院的以急性心肌梗死为首要初次诊断的患者89例,男性67例,女性22例,年龄38～81岁,平均(63.7±9.6)岁。入选标准:(1)年龄18～85岁,性别不限;(2)诊断依据《非ST段抬高型急性冠状动脉综合征诊断和治疗指南(2016)》[12]和《急性ST段抬高型心肌梗死诊断和治疗指南(2019)》[13];(3)发病时间在24 h内;(4)无论是否接受再灌注治疗(包括静脉溶栓和PCI)均可。排除标准:(1)严重贫血(血红蛋白<60 g/L);(2)血小板计数<100×109/L;(3)丙氨酸氨基转移酶或天门冬氨酸氨基转移酶>2倍参考值上限;(4)重度肾功能不全(Cockcroft-Gault公式估算肾小球滤过率<30 ml·min-1·1.73 m-2);(5)肿瘤终末期,感染性休克,结缔组织病,血液系统疾病,难治性高血压,急性脑卒中,糖尿病酮症或高渗昏迷,妊娠;(6)长期口服抗凝药物和糖皮质激素类药物。本研究经天津市人民医院伦理委员会批准[伦理审批号:(2019)年快审第(C02)号],每位研究对象均签署知情同意后进行。

1.2 研究分组

采用随机数字表方法将入选患者分为依洛尤单抗组45例和对照组44例。依洛尤单抗组于入院24 h内给予皮下注射1支(140 mg)依洛尤单抗注射液(生产厂家:Amgen Manufacturing Limited,国药批准文号:S20180021),14 d后再次注射1支。对照组不予注射。两组均于入院时给予负荷剂量的阿司匹林300 mg和替格瑞洛180 mg。此后每日常规应用抑制血小板聚集和他汀降脂药物,包括阿司匹林75～100 mg/次每日1次,替格瑞洛90 mg/次每日2次,瑞舒伐他汀10 mg/次每日1次。

1.3 观察指标

记录所有入选患者的临床特征,包括年龄、性别、急性心肌梗死分型(急性ST段抬高型心肌梗死和急性非ST段抬高型心肌梗死)、吸烟、高血压、糖尿病和卒中史。入院时均检测肝功能、血脂、高敏C反应蛋白和行超声心动图检查。分别于入院时(干预前)、第1个月检测血清PCSK9水平和血小板活化指标(CD63和CD62P双标阳性的百分比)。

1.4 检测方法

1.4.1 血清PCSK9水平检测 采用双抗体夹心法测定血清PCSK9水平,按照酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(上海酶联生物科技有限公司)说明书进行操作。

1.4.2 血小板活化指标检测 采用流式细胞术检测血浆中血小板CD62P与CD63双阳性表达的百分比。主要试剂:(1)美国BD公司生产的Monoclonal Antibody CD62P-FITC单克隆抗体;(2)美国BD公司生产的Monoclonal Antibody CD63-FITC单克隆抗体;(3)PBS液等。流式细胞仪:美国BD公司,型号:FACSCanto Ⅱ,Flowjo软件。

检测步骤:CD62P的阳性表达率测定:(1)以Flowcheck荧光微球检查仪器光路、流路,调整颜色补偿,该项工作由流式细胞实验室专业人员协助完成;(2)从-20℃冰箱中取出富含血小板血浆的待测液,使用微量加样枪各取5 μl;(3)取上样管两支,分别使用微量加样枪加入20 μl CD62P-FITC单克隆抗体和20 μl IgG1-FITC,并标记;(4)室温下避光反应20 min;(5)然后各加入PBS液4 ml;(6)反应后立即上机进行检测;(7)选择波长为488 nm的氩离子激光门,通过前向散射光(FSC)和侧向散射光(SSC)区分血小板群;(8)设置血小板门,将血小板群与其他颗粒及细胞区分,流速控制在100～200个/s;(9)每份标本检测 10 000个血小板,以同型对照阳性率大于0%,小于2%为界,设定阳性细胞门,计算荧光标记阳性血小板百分比,CD62P的表达率以阳性血小板所占全部检测血小板的百分比表示。操作过程严格按照试剂盒所标记的注意事项,以避免血小板激活,确保检验数据准确,检查及调整仪器等在试验各步骤之间等待的时间间隙顺利完成。CD63的阳性表达率测定:CD63阳性表达率使用CD63-FITC单克隆抗体,其具体操作步骤及注意事项参照上述CD62P的阳性表达率测定。

1.5 终点事件评价

本研究中主要不良心血管事件包括严重心脏事件和出血事件。严重心脏事件定义为冠心病相关死亡、非致死性心肌梗死、因心绞痛再入院。出血事件以2011年出血学术研究联合会(BARC)制定的出血分类标准定义[14],记录BARC出血1～2型、3或5型情况。

1.6 随访

于入组后第1、3、6、12和24个月分别进行随访,采取门诊复诊或电话随访方式,详细记录主要不良心血管事件发生情况,并于第1、6和12个月检测患者N末端B型利钠肽原、心电图和超声心动图。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 一般资料

两组患者的基线临床特征、血清PCSK9水平和血小板活化情况比较,差异均无统计学意义(均为P>0.05),见表1。

表1 两组基线资料比较

2.2 PCSK9水平的影响因素

纳入年龄、性别、高血压、糖尿病、卒中史、吸烟、梗死类型(前壁、下壁及非ST段抬高型心肌梗死)、血小板活化指标、高敏C反应蛋白、N末端B型利钠肽原和左心室射血分数建立多因素回归方程。结果发现,性别(B=285.894,t=2.093,P=0.040)和高敏C反应蛋白(B=-19.533,t=-2.356,P=0.021)对血清PCSK9水平的影响有统计学意义;血小板活化指标与血清PCSK9水平无相关性(B=-40.756,t=-1.148,P=0.255)。

2.3 依洛尤单抗对PCSK9水平和血小板活化的影响

依洛尤单抗组的血小板活化指标在干预前后存在统计学差异(Z=4.977,P<0.01),对照组则无统计学差异(Z=1.471,P=0.141),见图1、表2。依洛尤单抗组明显抑制了PCSK9水平,而对照组PCSK9水平无明显变化,见表3。

图1 两组干预前后血小板活化流式图

表2 干预前后血小板活化指标变化情况[M(Q1,Q3)]

表3 干预前后血清PCSK9水平变化情况

2.4 依洛尤单抗对急性心肌梗死患者预后的影响

本研究随访截止时间为2022年2月28日,中位随访时间为17.6个月,最短11.1个月,最长26.9个月。

依洛尤单抗组:因心绞痛就诊或再入院2例,其中1例行再灌注治疗;2例发生脑出血,其中1例于1个月时死亡;1例因急性心力衰竭住院期间死亡。对照组因心绞痛就诊或再入院8例,其中3例行再灌注治疗。两组因心绞痛就诊或再入院发生率比较,差异有统计学意义(χ2=4.21,P=0.04)。

2.5 出血事件比较及影响因素

两组BARC1或2型出血发生率比较,差异无统计学意义[17.8%(8/45)比9.1%(4/44),χ2=1.439,P=0.230];BARC3或5型出血情况:依洛尤单抗组发生2例颅内出血(其中1例死亡),对照组发生1例消化道出血,两组发生率比较差异无统计学意义(Fisher精确检验,P=0.509)。经过二元logistic回归分析,纳入入院时血小板活性指标和血清PCSK9水平两个因素,结果提示血清PCSK9水平是出血的独立风险因素(B=-0.36,t=15.405,P<0.01),见图2。

A:血小板活化指标联合PCSK9水平对出血事件的预测价值ROC曲线,显示预测率86.56%;B:PCSK9与出血事件的概率图,显示PCSK9水平越高,出血风险越低;C:血小板活化指标与出血事件的概率图,显示血小板活化指标越高,出血风险越高

3 讨论

PCSK9i显著降低动脉粥样硬化性心血管疾病患者低密度脂蛋白胆固醇水平和心血管事件发生风险的作用,已在大规模临床试验如依洛尤单抗的FOURIER等研究中得到明确证实[15-16]。此外,一系列人类临床试验也证实了PCSK9对止血系统的影响:前瞻性PCSK9-REACT研究显示,在接受PCI和P2Y12抑制剂的近期急性冠状动脉综合征患者中,血浆PCSK9水平与治疗期间高血小板反应性直接相关,提示PCSK9可能增强血小板活化[17]。急性心肌梗死患者在急诊PCI治疗后,严重影响预后的是急性冠状动脉内血栓事件,而急性期机体的应激炎症状态促使血小板处于活化状态,这就增加了血栓事件的发生风险。本研究基于既往的基础研究发现,观察PCSK9i对急性心肌梗死患者血小板活化状态的影响,并对非计划性血运重建等心脏事件进行了分析,结果显示,基于抑制血小板活化,PCSK9i(依洛尤单抗)能降低上述心脏事件的发生风险。

静止状态的血小板内分布着多种颗粒,如a颗粒、溶酶体颗粒等。这些颗粒表面存在着一些特定蛋白,如a颗粒表面有CD62P抗原,溶酶体颗粒表面有CD63抗原。血小板活化时,由于颗粒膜蛋白与血小板膜蛋白相互融合,使颗粒膜蛋白翻转到血小板膜表面。因此,可通过检测这些颗粒膜蛋白来判断血小板的活化状态[18]。本研究采用流式细胞检测的方法,检测CD63和CD62P双标阳性的血小板,来定义活化的血小板。结果显示,应用依洛尤单抗治疗能够较非干预组明显抑制血小板活化。Di Minno等[19]采用一种结合代谢组学和脂质组学的方法发现,应用PCSK9i治疗家族性高胆固醇血症患者可降低血小板活化因子及其前体的血浆水平。体外研究证实了CD36和Nox2激活介导的活性氧通路是PCSK9诱导血小板活化的潜在机制[20]。PCSK9i对血小板活性的影响凸显了PCSK9与人类血小板功能调节之间的相互作用。PCSK9i可降低氧化应激,调节ox-LDL途径和抑制Nox2激活,阻断花生四烯酸信号转导,并抑制健康人的血小板活化[21-22]。Barale等[23]研究证实,PCSK9i给药6个月后血小板活化降低,并发现23例杂合型家族性高胆固醇血症患者在PCSK9i治疗后血小板活化标志物(如CD62P表达、血浆可溶性CD40L、血小板因子4和可溶性P选择素)水平降低,这些标志物与血清PCSK9之间存在相关性。汇总既往研究和本研究结果提示,PCSK9i在与低密度脂蛋白受体结合的同时,也可能与血小板表面的相关受体结合,从而抑制血小板的活化。

近年来,PCSK9已被证实与动脉粥样硬化疾病进展过程中的血小板活化有关。这些研究的开展源于一个横断面调查,该研究从330例稳定型冠状动脉疾病患者中发现血浆PCSK9水平与血小板计数之间存在明确且独立的相关性[24]。Pastori等[25]研究发现,在心血管高危患者中,PCSK9升高与11-脱氢血栓素B2尿排泄量增加密切相关,11-脱氢血栓素B2是血栓素A2的一种稳定代谢物,提示PCSK9可能在调节血小板活化方面发挥作用。Camera等[8]的实验研究进一步印证了这些临床研究结果,他们利用动物模型研究PCSK9对血小板活化、聚集和血栓形成的影响,结果表明PCSK9基因的缺失降低了小鼠的血小板功能和动脉血栓的生成和稳定性。本研究通过多因素线性回归分析,未能证实急性心肌梗死患者体内血清PCSK9水平与血小板活化指标相关,与既往研究结果不同,分析原因可能是选取的标记物不同和未入选健康者作对照。

抑制血小板活化,减少血栓事件发生,势必减少了非计划再次血运重建的风险。但减少血小板活化,可能增加出血风险。相关研究发现,心绞痛患者血清PCSK9水平与活化部分凝血活酶时间和凝血酶原时间呈负相关[26],所以应用PCSK9i后降低血清PCSK9水平,可能延长活化部分凝血活酶时间和凝血酶原时间,势必增加出血风险。另一项长达两年的随访研究发现,凝血酶原时间延长为急性心肌梗死患者全因死亡的独立危险因素[27]。本研究结果显示,两组小出血事件发生率无统计学差异,但依洛尤单抗组发生了2例危及生命的颅内出血,对照组仅发生了1例消化道出血,所以出血风险需要进一步关注。

总之,应用PCSK9i可能抑制血小板活化,减少心血管事件风险,而是否增加出血风险尚需扩大样本量和延长观察时间。本研究显示PCSK9i(依洛尤单抗)有抑制血小板活化,从而减少心血管事件发生的趋势,如果增加样本量和应用干预药物疗程,可能效果会更明显。增加分子生物学机制进一步深究PCSK9i抑制血小板活化的机制是本研究进一步深入的方向。尽管本研究为PCSK9i提供了一种新的降胆固醇治疗作用外的多效性探索模式,为各类高危心血管患者的治疗提供了新的方向,然而此类药物确切的疗效与安全性仍有待更多的临床研究论证[28]。后期研究还应增加更多安全性指标的监测,如药物依赖性和相关抗体的产生等,也是本研究的不足之处。

利益冲突：无