基于宏基因组学解析高温大曲微生物群落与功能的异质性

张芮，刘文虎，张立强，杨阳，魏阳，王松涛，冉茂芳，王世宽，沈才洪*

（1.四川轻化工大学生物工程学院，四川自贡 643000；2.泸州品创科技有限公司/国家固态酿造工程技术研究中心，四川泸州 646000；3.泸州老窖股份有限公司，四川泸州 646000）

大曲是传统白酒酿造的重要原料之一，起到糖化、发酵、酒化和生香的作用，对白酒的出酒率和酒质有极大的影响[1-3]。根据曲坯中心最高发酵温度的不同，大曲分为低温大曲（45～50 ℃）、中温大曲（50～60 ℃）和高温大曲（60～65 ℃），其中，高温大曲用于酱香型白酒的生产。高温大曲以小麦为主要原料，经自然堆积发酵而成，原料粉碎、水分含量、发酵温度、安曲方式、发酵方式、过程管控等是影响高温大曲质量的重要因素，上述因素的差异导致曲药表面呈现黑褐色（黑曲）、黄褐色（黄曲）和生麦色（白曲）[4-6]。正常情况下，高温大曲发酵过程中所产黄曲的占比最高，占总产量的70 %～80 %，黑曲和白曲分别占10%和10%～20%。黑曲通常出现在发酵房中央，白曲通常出现在顶层或靠近门窗的位置[7]。由不同因素产生的3种高温大曲的微生物群落结构各不相同，黄曲和黑曲中的优势菌分别为克罗彭斯特菌属（Kroppenstedtia）和嗜热子囊菌属（Thermoascus），白曲中的主要细菌及真菌类群分别为海洋芽孢杆菌属（Oceanobacillus）和嗜热真菌属（Thermomyces）[8]。黑曲、黄曲和白曲之间的理化性质和生物酶活力存在显著差异，黑曲的酸度最高，黄曲最低；白曲的糖化力和酯化力最高，黑曲的最低[9]。Deng等[10]利用扩增子测序手段对采集自不同地区、不同颜色的高温大曲进行研究，发现克罗彭施泰特氏菌属（Kroppenstedtia）、芽孢杆菌属（Bacillus）和嗜热子囊菌属（Thermoascus）为高温大曲中的优势微生物，此外，黑曲中的主要菌群还包括糖多孢菌属（Saccharopolyspora）和嗜热真菌属（Thermomyces），黄曲中的优势菌群还包括未分类的散囊菌目（Eurotiales）真菌，表明黑曲、白曲和黄曲的理化指标、酶活力及功能微生物群落结构差异显著。

目前，高温大曲的研究已经成为热点，涉及了功能微生物、理化指标和风味差异等方面，但对功能微生物功能层面的研究相对较少。本文基于宏基因组学，对同批次黑、黄、白色高温大曲微生物群落与功能组成进行比较分析，进一步预测引起3种高温大曲品质差异的代谢途径，为深入阐明高温大曲的异质性奠定了基础，以期指导3种高温大曲在酱香型白酒生产中的应用。

1 材料与方法

1.1 样品

高温大曲样品采自贮曲仓不同位置且贮存了3个月的白曲（White_Daqu）、黄曲（Yellow_Daqu）和黑曲（Black_Daqu）各3 块。分别粉碎混匀后，装于无菌自封袋中，贮存于-20 ℃待测。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA 提取和宏基因组测序

称取10g 高温大曲样品，用中通量组织研磨仪（鼎昊源，中国）结合液氮冷冻研磨成细粉。采用土壤DNA 试剂盒（Omega，美国）提取DNA，并用1 %琼脂糖凝胶电泳检测DNA 提取质量，采用Nano‐Drop2000 微量分光光度计（Thermo Scientific，美国）检测DNA 纯度和浓度。合格的DNA 样品用干冰寄送至上海美吉生物医药科技有限公司使用HiSeqTM X Ten 系统（Illumina，美国）进行宏基因组测序。

1.2.2 序列处理和注释

使用SOAPnuke（v1.5.6）[11]对下机原始数据进行质控过滤：去除包含不确定碱基（N 碱基）的序列，去除含50%以上低质量碱基（Q＜20 的碱基）的序列，去除含测序接头的序列，去除长度＜50 bp 的序列，使用snap-aligner (v1.0beta.23)[12]和samtools(v1.8)[13]过滤宿主序列，将有效数据用于后续生物信息学分析。

使用MegaHit（v1.1.2）对上述有效数据进行组装，通过MetaGeneMake（v2.1.0）[14]对组装序列进行开放阅读框（Open Reading Frames，ORFs）预测。使用CD-HIT（v4.7）[15]将相似度在95%以上且比对区域大于90 %的序列聚类为一个单元，以去除重复的冗余序列，构建样品非冗余基因集（Unigene Catalog）。使用Bowite2（v1.2.2）[16]将样品的高质量序列与基因集比对，采用Pathoscope（v1.0）[17]将序列重新分配至“最可能来源”的基因。

使用DIAMOND（v0.8.3.6）[18]将编码基因映射至NR 数据库（Non-redundant Protein Sequences from GenPept,Swissprot,PIR,PDF,PDB,and NCBI RefSeq）和KEGG 数据库（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes），获得相应基因的注释信息。基于NR 数据库比对结果，使用MEGAN（v6）[19]进行微生物物种信息注释，并计算该物种的丰度。

2 结果与分析

2.1 测序数据统计

黑曲、黄曲、白曲高温大曲样品中提取的DNA经宏基因组测序，共获得693,414,364 条序列（77,046,040±3,473,586 条，Mean±SD，n=9），合计104.7 Gbp 的原始数据，其中97.5 %的序列为高质量序列，共计101.7 Gbp。高质量序列经过Megahit 软件单拼共得1,060,673 条重叠群序列（Contigs），经过MetaGene 软件共预测得1,649,504 个开放阅读框，经CD-HIT 软件聚类得714,190 个基因组成的非冗余基因集，基因平均长度为492 bp，表明测序质量可以用来表征3种高温大曲样本的微生物群落结构。

2.2 微生物群落结构与差异分析

非冗余基因集中共有501,795 个基因（70.3 %）在NCBI NR（v 20200604）数据库中具有明确的物种注释信息，分布于467 个目（Order）、2071 个属（Genus）中。主坐标分析显示（图1A），黑曲和黄曲的微生物群落结构相近，在PCoA 1 轴上无法区分两者，且均与白曲差异明显。ANOSIM 相似性分析（图1B）也显示3种高温大曲微生物群落组成差异显著（R=0.74，P=0.002），这种差异反映出造成它们理化性质、酶活、代谢物等方面差异的微生物基础[20-21]。

黑曲、黄曲中微生物群落以真菌为主，真菌属累计相对丰度分别为93.9 %、96.3 %，罗萨氏菌属（Rasamsonia）、曲霉属（Aspergillus）、丝衣霉属（Byssochlamys）、篮状菌属（Talaromyces）、青霉菌属（Penicillium）为优势真菌，均属于散囊菌目，在两者中的相对丰度分别为72.8 %和80.1 %。黑曲中丝衣霉属（Byssochlamys）相对丰度显著高于黄曲（T检验，P＜0.05），黄曲中篮状菌属（Talaromyces）、青霉菌属（Penicillium）相对丰度显著高于黑曲。黑曲和黄曲中细菌群落结构相似，相对丰度极低，优势高温放线菌属（Thermoactinomyces）相对丰度仅2.0 %左右；黑曲中链孢子菌属（Desmospora）相对丰度显著高于黄曲，其他细菌属相对丰度无显著差异（T 检验，P＞0.05）。

白曲中微生物群落以细菌为主，细菌属累计相对丰度达66.6 %，真菌属相对丰度仅33.3 %（图1C和图1D）。白曲中以克罗彭施泰特氏菌属（Kroppenstedtia，相对丰度19.6%）、链孢子菌属（Desmospora，相对丰度10.7 %）、枝芽孢菌属（Virgibacillus，相对丰度8.5 %）、芽孢杆菌属（Bacillus，相对丰度3.5 %）等细菌为主，相对丰度普遍高于黑曲和黄曲。对于真菌群落结构，白曲中罗萨氏菌属、曲霉属、丝衣霉属、篮状菌属、青霉菌属的相对丰度累计为21.1 %，显著低于黑曲和黄曲。值得注意的是，白曲中横梗霉属（Lichtheimia，相对丰度1.9 %）、根霉属（Rhizopus，2.5 %）相对丰度明显高于黑曲、黄曲，且两者均属于毛霉目（Mucorales）。上述研究结果与已有的文献报道相一致[22-24]。

图1 高温大曲微生物群落结构

进一步探究了不同高温大曲的标志性微生物，采用相对丰度排名前二十的微生物属进行线性判别分析（Linear Discriminant Analysis-Effect Size，LEfSe）（图1E）。结果显示，黑曲的标志性微生物为曲霉属，黄曲的标志性微生物为青霉菌属和散囊菌目等，白曲的标志性微生物包括克罗彭施泰特氏菌属、链孢子菌属和芽孢杆菌属。表明黑曲和黄曲之间的差异主要归结于真菌群落组成的异质性，白曲中更加丰富多样的细菌群落使其明显区别于黑曲和黄曲。

2.3 基于CAZy 数据库的碳水化合物活性酶组成与差异分析

非冗余基因集中共有11,825 条基因（1.7 %）在碳水化合物活性酶数据库（Carbohydrate-active En‐zymes Database，CAZy）中具有明确的功能注释信息，共计395 个碳水化合物活性酶，包括208 个糖苷水解酶（Glycoside Hydrolases，GHs），73 个糖基转移酶（Glycosyl Transferases，GTs），44 个多糖裂合酶（Polysaccharide Lyases，PLs），15 个碳水化合物酯酶（Carbohydrate Esterases，CEs），31 个碳水化合物结合模块（Carbohydrate-Binding Modules，CBMs），24个辅助氧化还原酶（Auxiliary Activities，AAs）。如图2A 所示，黑曲和黄曲中碳水化合物活性酶基因累计丰度分别为17,333.3 和16,830.0（TPM），显著低于白曲（TPM：18,384.8）（图2A）。

如图2B 所示，GHs 是高温大曲中种类最多、基因丰度最高的碳水化合物活性酶类[25]，黑曲、黄曲和白曲中的GHs 基因丰度依次降低，可能造成三者中还原糖含量、高温条件下的美拉德反应和褐变反应存在差异，进而形成3种高温大曲的颜色差异。根据GHs 基因的物种贡献度信息，黑曲和黄曲的GHs 主要源于罗萨氏菌属、丝衣霉属、曲霉属等，后者中的GHs 基因还来源于篮状菌属、嗜热真菌属等。黑曲和黄曲中绝大部分GHs 基因源于散囊菌目真菌，白曲中的GH 基因源于芽孢杆菌目（Bacil‐lales）和散囊菌目，其中，芽孢杆菌目主要包括链孢子菌属、克罗彭施泰特氏菌属、枝芽孢菌属等。同GHs 基因相似，黑曲和黄曲中的AAs 基因也主要源于散囊菌目真菌，白曲中的AAs 基因源于芽孢杆菌目和散囊菌目。

图2 高温大曲碳水化合物活性酶组成

图3 高温大曲微生物群落的代谢功能差异

黑曲、黄曲和白曲中的GTs 基因丰度较高，随着大曲颜色变浅，GTs 基因丰度升高。黑曲和黄曲中的GTs 基因主要来源于罗萨氏菌属、篮状菌属、丝衣霉属、曲霉属等，白曲中主要源自克罗彭施泰特氏菌属、链孢子菌属、枝芽孢杆菌属等细菌。相对丰度最高的克罗彭施泰特氏菌属、链孢子菌属、枝芽孢菌属等细菌也使得白曲中CEs 和PLs 基因丰度高。白曲中较高丰度的GTs、CEs、PLs 基因可能是其糖化力、液化力、酯化力比黑曲和黄曲高的原因之一。

2.4 基于KEGG 数据库的微生物群落功能组成与差异分析

非冗余基因集中共有193,772 条基因（27.1%）在KEGG 数据库（v 94.2）中具有明确的功能注释信息，共计10006 个KO（KEGG Orthology）。将这些KO 映射到与微生物活动相关的途径（KEGG Path‐way），即代谢（Metabolism）、遗传信息处理（Genet‐ic Information Processing）、环境信息处理（Environ‐mental Information Processing）、细胞过程（Cellular Processes）。与碳水化合物活性酶总基因丰度类似，随着高温大曲颜色变浅，KEGG 途径的总TPM基因丰度依次升高。

基于KEGG Pathway Level 1（L1）、Level 2（L2）基因丰度的LEfSe 分析如图3A 所示。黑曲的标志性微生物活动途径为异源物生物代谢和降解（Xe‐nobiotics Biodegradation and Metabolism），微生物群落可能代谢更多的异源物质，产生多种代谢物，并有助于提升黑曲的香气浓郁度。黄曲的标志性微生物活动途径为遗传信息处理、环境信息处理、细胞过程（L1），黄曲中与基因、环境信息处理相关的代谢活动较为旺盛。白曲的标志性微生物活动途径为氨基酸代谢（Amino Acid Metabolism）、其他次级代谢产物的合成（Biosynthesis of Other Second‐ary Metabolites）等。

进一步基于KEGG Pathway L2、Level 3（L3）基因丰度的LEfSe 分析如图3B 所示。黑曲中与能量代谢（Energy Metabolism）相关的氧化磷酸化途径基因丰度最高，主要源于曲霉属、篮状菌属等真菌（图3C），推测黑曲中的能量代谢活动最为旺盛，释放大量的生物热，使黑曲拥有更高的发酵温度。黑曲中的标志性代谢途径也包括异源物生物代谢和降解（L2）的10 个L3 途径，基因主要源于丝衣霉属、罗萨氏菌属、曲霉属等真菌，涉及大量的芳香族化合物代谢，表明此类丝状真菌可能促进黑曲中芳香族化合物的积累。黄曲的标志性代谢途径主要是脂质代谢（Lipid Metabolism）、聚糖的生物合成与代谢（Glycan Biosynthesis and Metabolism），主要为罗萨氏菌属、篮状菌属等真菌的功能活性。

白曲中丝状真菌相对丰度较低，其能量代谢、异源物生物代谢和降解、脂质代谢、聚糖的生物合成与代谢下的L3 途径等的基因丰度低于黑曲和黄曲，可能导致白曲的代谢活力较低，进而使白曲的发酵温度和香气浓郁度较低。白曲的标志性代谢途径主要分布于碳水化合物代谢（Carbohydrate Metabolism）、氨基酸代谢、核苷酸代谢（Nucleotide Metabolism）、辅助因子和维生素代谢（Metabolism of Cofactors and Vitamins），相关基因主要源于克罗彭施泰特氏菌属、枝芽孢菌属、链孢子菌属等细菌。

综上所述，黑曲和黄曲的优势微生物主要为多种丝状真菌，其参与次级代谢的能力较强，可能有利于提高酱香型白酒风味的多样性和丰富度。黄曲的微生物群落具有较强参与遗传信息处理、环境信息处理、细胞过程的能力，说明黄曲微生物群落可能具有良好的适应能力，新建窖池试生产、酒醅发酵异常时可作为通用高温大曲使用。白曲中大量存在的细菌群落能广泛参与基础代谢，比如丙酮酸代谢（Pyruvate Metabolism）、三羧酸循环（Citrate Cycle）等，因此，在酱香型白酒堆积发酵阶段，可适当提高高温大曲中白曲的比例，利用白曲中丰富的细菌群落以及更高的液化力、糖化力，加速微生物基础代谢水平，缩短堆积时间，提高生产效率。

3 结论

本试验应用宏基因组学深入分析了黑曲、黄曲和白曲的微生物群落与潜在功能的差异。研究结果表明，黑曲和黄曲中优势微生物均属于散囊菌目，黑曲中主要以罗萨氏菌属、曲霉属、丝衣霉属等真菌为主，这些真菌拥有较多的GHs、AAs 基因以及与能量代谢、异源物生物代谢和降解相关的生物酶基因；黄曲中主要以罗萨氏菌属、篮状菌属、曲霉属等真菌为主，它们携带较多的GHs、GTs，以及与脂质代谢、聚糖合成和代谢等相关的生物酶基因；白曲中主要以芽孢杆菌目细菌为主，如克罗彭施泰特氏菌属、链孢子菌属、枝芽孢菌属、芽孢杆菌属等，这些细菌含有较多的GTs、CEs、PLs 基因，可能使白曲拥有较高的糖化力、液化力、酯化力。此外，芽孢杆菌目细菌还具有较强的碳水化合物代谢、氨基酸代谢、核苷酸代谢以及代谢辅助因子和维生素的能力。本文进一步明确了高温大曲微生物群落与功能组成的异质性，为不同类型高温大曲的工艺研究及应用场景提供了参考。