Keap1/Nrf2/ARE信号通路及激活剂在帕金森病研究中的进展

黄婷芸,黄南渠,保玉心,3

(1.遵义医科大学 第一临床学院,贵州 遵义 563099;2.遵义医科大学第三附属医院 药物临床试验机构办公室,贵州 遵义 563000;3.遵义医科大学 生命科学研究院,贵州 遵义 563099)

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种以黑质致密部多巴胺能神经元缺失为特征的进行性神经退行性疾病,主要表现为运动调节受到严重损害［1],近年来该病患病率呈逐年上升趋势,据预测,到2040年,全球帕金森病患者人数预计将超过1 200万人［2]。PD正在成为与年龄相关的主要健康问题［3]。PD的病理特点为黑质多巴胺能神经元的退化、纹状体多巴胺减少和神经元内异常蛋白聚集体路易小体的形成,其主要包括α-突触核蛋白、泛素、Parkin蛋白、PTEN诱导激酶1 (PTEN-induced putative kinase 1, PINK1) 和存活神经元中的其他蛋白质［4]。导致这一病理改变的确切病因仍不清楚,氧化应激、线粒体功能障碍、异常蛋白聚集等均可能参与PD多巴胺能神经元的变性死亡过程。尽管PD的确切机制尚不清楚,但氧化应激和神经炎症是可能导致多巴胺能神经元损伤的两种主要致病机制［5]。所以,抗氧化疗法逐渐成为近些年来帕金森病的重要研究方向,Keap1/Nrf2/ARE信号通路是抗氧化应激的中枢防御机制,在PD的发生发展过程中起着关键作用。本文将以抗氧化应激的角度探讨Keap1/Nrf2通路在PD治疗中的作用,以及天然植物抗氧化剂调节Nrf2通路治疗PD的研究进展,希望能为PD提供新的治疗思路。

1 Keap1/Nrf2/ARE通路调控方式

Keap1/Nrf2/ARE途径是氧化应激的日常生物学反应中心,它调节许多抗氧化基因的转录,保持细胞稳态。Nrf2作为调控氧化应激的一种关键转录因子,控制多种下游抗氧化和细胞防御基因［6],在诱导机体的抗氧化应答中起着重要作用,如调节氧化还原、能量代谢、铁代谢、自噬、蛋白酶体降解、DNA 修复和线粒体生理机能。Nrf2具有7个Nrf2-ECH同源结构域 (Neh1-7) 的模块化蛋白质,每个结构域都实现不同的功能［7]。Nrf2属于碱性亮氨酸拉链(bZIP)转录因子家族,并保留cap-n-collar (CNC)结构。其N端的Neh2结构域是抑制蛋白E3泛素连接酶复合物底物(cullin3 / ring-box1)接头蛋白Keap1的结合位点。Keap1是Nrf2的负调节因子,分为5个不同的区域［8],它是Cullin3 (Cul3) 依赖性的 E3 泛素连接酶复合物的底物衔接蛋白,可与 Cul3 和 Rbx1 组装成功能性 E3 泛素连接酶复合物 (Keap1-Cul3-E3),进而对 Nrf2 进行调控［8]。Nrf2的活性受其细胞质阻遏蛋白Keap1的严格控制,Keap1作为Cul3-dependent E3泛素连接酶复合物 (Cul3/Rbx1 E3泛素) 的底物,可促进Nrf2的泛素化及其被蛋白酶体快速降解以维持Nrf2水平。在非应激条件下,Nrf2的Neh2结构域与Keap1的DGR区域结合,以锚定在细胞质中,Keap1底物衔接蛋白Cul3通过26S蛋白介导Nrf2的泛素化和进一步降解以维持Nrf2的基础水平,保持在生理状态下Nrf2的低转录活性。但在诱导条件下或暴露于不同的应激源后,Nrf2与Keap1分离并易位到细胞核中,与小Maf(肌腱膜纤维肉瘤癌基因同源物)蛋白结合成异质二聚体,识别并结合ARE序列［9],激活大量抗氧化反应基因,调控Ⅱ相解毒酶、抗氧化酶和转运蛋白基因的转录,从而发挥抗氧化损伤作用,促进多种细胞保护蛋白的表达并恢复细胞稳态。

2 帕金森病与氧化应激

在PD的发病机制中,氧化应激是导致多巴胺能神经元变性的重要因素。氧化应激被定义为自由基和反应性代谢物或活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生与消除之间的不平衡。高反应性ROS、RNS容易与生物分子相互作用,引发一系列反应,从而导致线粒体功能障碍,受损的DNA修复和细胞损伤最终导致神经退行性疾病。在生物学背景下,ROS为氧的正常代谢副产物,并且在细胞信号传导和体内平衡中有重要作用。当机体处于氧化应激时,ROS水平会急剧增加,对机体细胞造成损害。但是,氧化应激本身并不是病理性的,在细胞氧化还原不平衡情况下才导致ROS的大量积累而引起神经元损伤。线粒体是ROS产生的关键位点,也是ROS诱导损伤的靶点,线粒体中电子转运链破坏导致ROS升高,引起线粒体功能损害,导致细胞受损［10-11]。当ROS的产生和抗氧化防御之间的平衡失衡时,会引发过多ROS的积累,从而发生氧化损伤,过量的活性氧会破坏大分子物质结构(如脂类、蛋白质和核酸),导致其生理功能的缺陷,其中多巴胺能神经元更容易受到氧化损伤,导致细胞变性和PD的发生发展［12]。在散发性和家族性PD中能观察到黑质氧化应激升高［13-14],也因此表明黑质致密部的氧化应激是导致多巴胺能神经元丢失的重要机制。另外,多巴胺(dopamine,DA)代谢也是氧化应激的另一来源。正常情况下,多巴胺能神经元中的DA被囊泡单胺转运蛋白2 (vesicular monoamine transporter 2,VMAT2)摄取并保留在突触囊泡中,胞质间过量的DA通过单胺氧化酶(monoamine oxidase,MAO)分解代谢为ROS或经过自动氧化产生多巴胺醌和半醌。DA通过MAO代谢产生过氧化氢,其后转化为反应性极强的羟基自由基,从而导致氧化应激［15]。虽然到目前为止,PD的确切发病机制仍未完全弄清,但氧化应激已被广泛接受为触发神经细胞退化和参与大部分神经退行性疾病的重要发病机制,抗氧化疗法已成为治疗PD的重要研究方向。

3 Keap1/Nrf2/ARE对多巴胺能神经元氧化应激的调节作用

Keap1/Nrf2/ARE通路活化已成为调节PD的希望靶点［16]。Nrf2能控制、调节和维持解毒酶和抗氧化反应元件以及其他类型的保护元件的表达,因此它的激活在对抗急性损伤、外源性效应、炎症和其他由氧化应激促进的刺激方面发挥了相当大的作用。由Nrf2/ARE调节的基因列表包括超过250个基因,其编码参与抗氧化防御和解毒的蛋白质和酶［17],激活Keap1/Nrf2/ARE通路可以上调其下游靶蛋白的表达,从而减轻细胞氧化应激并使细胞恢复正常功能,常见的下游靶蛋白有γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-glutamylcysteine synthetase,γ-GCS)、谷氨酸半胱氨酸连接酶(glutamate cysteine ligase, GCL)及其亚基、NAD(P)H:醌氧化还原酶1(NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1,NQO1)和血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)［18]。有研究表明,Nrf2基因敲除小鼠表现出协调基因调控程序的严重缺陷和对氧化损伤的极端易感性,这表明Nrf2在抗氧化防御中具有不可替代的作用,因此,刺激Keap1/Nrf2/ARE信号通路的激活以诱导其下游靶基因表达可以对抗PD中多巴胺能神经元发生的氧化应激(表1)。

表1 Keap1/Nrf2/ARE通路下游靶基因调控机制

3.1 Nrf2对γ-GCS的调控 γ-GCS是谷胱甘肽(glutathione,GSH)合成过程中的限速酶。增加γ-GCS的含量和活性可以促进GSH的合成及增强组织细胞的抗氧化应激能力。Waugh等［19]发现Nrf2与下游靶基因γ-GCS的正相关性表达,即下调Nrf2活性也会使γ-GCS表达下调,从而导致GSH水平降低使细胞易发生氧化损伤。Xiong等［20]通过薏仁酚类化合物(N1, N5-di-［(E)-p-coumaroyl]-spermidine,NDPS)诱导的HepG2肝癌细胞模型,观察到随着NDPS浓度的增加,Nrf2和γ-GCS在细胞核中的表达也随之增加,这也证实了Nrf2与γ-GCS的密切关系。Shi等［21]也发现激活Keap1/Nrf2通路能上调γ-GCS表达,减轻细胞的氧化损伤。综上,可以表明γ-GCS是Nrf2调控的下游靶基因,且激活Keap1/Nrf2通路可以上调γ-GCS的表达从而保护细胞抗氧化损伤。

3.2 Nrf2对GCL的调控 GCL是由不同基因编辑的谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基(glutamate cysteine ligase catalytic subunit,GCLC)及其修饰亚基(glutamate cysteine ligase modifier subunit,GCLM)组成,是参与合成GSH的关键酶。细胞的氧化还原状态能够影响GCL的活性从而调控GSH的形成。GCLM是GSH生物合成中的限速酶,也是GCLC修饰亚基,其通过调节GCLC与谷氨酸(glutamate,Glu)亲和性从而有效控制GSH在细胞内的浓度。作为体内重要的抗氧化剂和自由基清除剂,有研究报道GSH水平可能与GCL限速酶异常表达或活性变化相关。目前已有多种证据表明GCLM、GCLC的表达受到 Nrf2的调控并发挥了重要的抗氧化作用。Hou等［22]在PD模型中观察到激活Nrf2/ARE途径能上调下游基因GCLM、GCLC等以减轻氧化应激反应。Chen等［23]也证实了通过激活Nrf2诱导GCLM、GCLC表达以清除ROS保护细胞免受氧化损伤。此外,激活Nrf2对PD的调节的积极作用在研究中也有报道。Huang等［24]在PD小鼠模型中发现提高Nrf2活性可以抑制小鼠帕金森病。Huang等［25]在MPTP诱导的PD模型中也观察到激活Nrf2能上调下游抗氧化蛋白GCLM、GCLC以抗氧化应激,促进多巴胺能神经元的增殖及保护其免受抗氧化应激损伤。因此,GCLM、GCLC作为Nrf2的下游靶基因,激活Nrf2通路在PD氧化损伤的修复发挥着重要作用。

3.3 Nrf2对NQO1的调控 NQO1是Ⅱ相解毒酶家族的一员,催化神经毒性多巴胺-邻醌的双电子还原。NQO1对苯衍生的醌类进行解毒,并生成抗氧化剂形式的泛醌和维生素E,它是一种具有广泛细胞保护功能的Nrf2靶标酶,因其具有强大的细胞保护作用,所以被许多学者称为“多功能抗氧化剂”和“万能的细胞保护剂”。许多研究显示,NQO1为Nrf2的下游产物,Nrf2的激活可刺激NQO1的表达。Petrillo等［26]发现,PD患者中的Nrf2表达上调,且下游靶点NQO1、GCL和GR18水平也随之升高,表明Nrf2和NQO1表达的正相关性。而Kaji等［27]用鱼藤酮诱导的PD小鼠模型进行实验观察也验证了这一观点。另外,Huang等［28]在PD模型中观察到活化Nrf2/NQO1信号通路可以减轻PD小鼠的神经炎症。这一发现在其他研究中也相继得以证实。其中,Yang等［29]在MPTP诱导的细胞模型中观察到激活Nrf2后NQO1基因的表达显著上调,从而抑制PD中多巴胺能神经元的氧化损伤。Huang等［30]在MPTP诱导的PD小鼠大脑模型中发现其NQO1表达明显减少,但可通过激活Nrf2通路逆转这一现象。此外,Chen等［31]也证实,在MPP+诱导的PD模型中上调Nrf2基因表达,其下游靶基因NQO1和HO-1的表达也随之上调,从而清除自由基增强细胞对神经毒性的抵抗。综上所述,NQO1是Keap1/Nrf2/ARE信号通路产生的关键酶,激活Nrf2基因通过抗氧化应激以能减轻多巴胺能神经元的损伤,对PD的发生发展具有保护作用。

3.4 Nrf2对HO-1的调控 HO-1是一种由Nrf2调节的抗氧化酶,可将血红素降解为一氧化碳、游离铁和胆绿素［32]。胆绿素具有抗炎、抗氧化、抗凋亡和血管舒张功能。HO-1是Ⅱ期解毒酶之一,由其诱导的下游信号轴对多个器官的氧化应激具有保护作用［33]。在ROS失调时,HO-1可通过其抗氧化特性减轻ROS带来的不良作用［34]。有研究报道在PD患者的血清中发现较高浓度HO-1［35],且Nrf2与HO-1、NQO1表达上调的一致性。Jazwa等［36]发现注射Nrf2激活剂萝卜硫素可增加基底神经节Nrf2蛋白水平,并导致HO-1、NAD(P)H和NQO1上调。此外,激活HO-1对神经元具有保护作用。Kwon等［37]发现金丝桃苷通过激活Nrf2/HO-1转录信号通路抑制了6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)诱导的氧化应激引起的神经细胞死亡,从而表现出显着的神经保护作用。此研究被ParK等［38]证实,即在MPTP诱导的PD模型小鼠中观察到,β-LAP(一种从重木树中分离的天然萘醌化合物)可以增加上游Nrf2、p-AMPK及其下游HO-1的信号表达,从而发挥神经保护作用。此外,Inose等［39]在PD模型小鼠中发现Nrf2激活剂可以上调HO-1表达从而抑制PD模型小鼠的多巴胺能神经元死亡。Selvakumar等［40]也发现利用CRISPR/Cas9编辑技术敲除GMF(一种炎症调节剂)可抑制MPP+诱导的BV-2小胶质细胞氧化应激,促进Nrf2核转位从而增加HO-1的表达以防止小胶质细胞激活导致的神经炎性介质过度活化和表达,从而阻止多巴胺能神经元的进行性丢失。因此,多种研究表明,HO-1是Nrf2通路的下游靶蛋白产物之一,且激活Nrf2后对多巴胺能神经元的保护发挥重要作用［41]。

4天然植物抗氧化剂用于治疗PD

目前,临床上关于治疗PD的药物以单胺氧化酶抑制剂、多巴胺受体激动剂和多巴胺药物常见。然而现有的治疗方法,虽然在一定时期内对运动症状的改善有效,但对神经保护和疾病进程的阻止或延缓并无作用,甚至还有加重精神类症状的风险［42]。故研究者们一直致力于寻找能够改善PD且副作用较小的物质。目前对于天然植物抗氧化剂有效成分与信号传导通路的关联性有较多研究。天然植物中主要的抗氧化成分包括植物多酚类、维生素类、植物多糖类及其他抗氧化活性成分。已有研究发现天然植物抗氧化剂能有效激活Nrf2/ARE通路并调控其下游靶蛋白以抗氧化应激从而对神经细胞发挥保护作用。植物化学物质的来源、类型及调控方式(表2)。

表2 天然植物抗氧化剂有效成分对PD的影响

4.1 植物多酚类 植物多酚类包括植物单宁、黄酮类化合物、酚酸类化合物。鞣花酸是天然酚酸类化合物,存在于草莓、黑莓、树莓、核桃和石榴中［43]。鞣花酸可激活Nrf2及下游靶蛋白［44],Xu等［45]观察到鞣花酸可通过上调Nrf2/ARE通路及下游NQO1和HO-1来增强小鼠的抗氧化能力。Sarkaki等［46]通过口服50 mg/kg鞣花酸在6-OHDA(16 μg/2 μL)诱发的PD大鼠模型中观察到鞣花酸的神经保护作用。阿魏酸是一种源自蔬菜和水果的酚酸类化合物,Li等［47]发现阿魏酸可以通过活化Nrf2通路在PD小鼠的体内外模型中发挥抗氧化作用,对PD的治疗具有重要的转化价值。鼠尾草酸也是酚酸类化合物,主要存在于食用植物鼠尾草和迷迭香中,有研究发现鼠尾草酸可以激活Nrf2/ARE通路保护神经细胞免受氧化应激及炎症刺激［48]。丹参素是中药丹参提取物中的活性成分,属酚酸类化合物,Wang等［49]发现丹参素通过激活Nrf2下游的HO-1、GCLC和GCLM蛋白的表达,对鱼藤酮诱导的PD小鼠具有神经保护作用。另外,槲皮素［50-52]、淫羊藿苷［53]、松属素［51, 54]、异甘草素［51, 55]、橙皮素［56]、巴西木素［57]、杨梅素［58]和高良姜素［59]均为黄酮类化合物,有报道它们在体内和(或)体外实验模型中能激活Nrf2/ARE信号通路以调控其下游靶蛋白从而发挥抗氧化应激及神经保护作用。

4.2 维生素类 维生素及其衍生物是人体重要的抗氧化物质,它们在特定情况下也可成为促氧化剂。有报道这类物质能活化Nrf2/ARE通路改善细胞氧化应激。常见的维生素类抗氧化剂有维生素C、维生素E、类胡萝卜素及其衍生物。维生素C是维持人体正常生理功能必需的水溶性维生素,主要来源于蔬菜和水果,如酸枣、山楂、柑桔、草莓、西红柿、弥猴桃、青辣椒等。有报道维生素C可以激活Keap1/Nrf2/ARE信号通路发挥抗氧化损伤作用［60]。Zhang等［61]发现高剂量维生素C能减轻海马组织病理学变化,减少神经炎症,抑制脑组织中的氧化应激,并上调Nrf2和HO-1的表达。目前针对维生素C对神经细胞抗氧化损伤机制研究多以阿尔兹海默症(Alzheimer’s disease,AD)展开,而在PD模型中的关联性如何,还有待进一步研究。维生素E是脂溶性维生素,Fang等［62]在体内研究中观察到维生素E能通过激活Nrf2/HO-1减轻细胞氧化损伤。类胡萝卜素是在大多数水果和蔬菜、植物、藻类和光合细菌中发现的天然存在的色素,人类不能自身合成,须通过食物或补充剂摄取它们。许多研究表明类胡萝卜素具有抗氧化作用,如番茄红素［63]、岩藻黄素［64]、叶黄素［65]、β-胡萝卜素［66]已在体内和(或)体外研究中证实可以上调Nrf2及其下游靶蛋白减轻细胞氧化损伤,具有神经保护作用,未来可以作为防治神经退行性疾病的切入点。尿酸属于天然植物抗氧化剂有效成分中的维生素类衍生物,是膳食嘌呤的终产物,也是人体血浆中的主要水溶性低分子抗氧化剂。尿酸可通过激活Nrf2来保护多巴胺能神经元免受氧化应激的损伤［67]。Lin等［68]观察到尿酸可以激活Nrf2抗氧化通路。Huang等［69]在MPTP诱导的PD小鼠模型中也发现,向小鼠腹腔注射250 mg/kg尿酸,PD小鼠的行为表现和认知能力发生改善,并上调了Nrf2、GCLC、HO-1和NQO1蛋白表达,同时也增加了黑质中TH阳性多巴胺能神经元,对PD小鼠多巴胺能神经元具有神经保护作用。

4.3 植物多糖类 植物多糖是由十种或更多种单糖通过糖苷键聚合而组成的化合物,研究发现,许多植物中的多糖具有显著的抗氧化特性,主要通过内源性抗氧化应激Nrf2/ARE途径来调控下游抗氧化酶的表达,在调节人体生理功能方面发挥着重要作用。黑果腺肋花楸是一种具有多种生物活性的天然药用植物,其果实常用于食物和药品,黑果腺肋花楸多糖是黑果腺肋花楸果实的主要成分。Zhao等［70]在衰老小鼠体内研究中发现,黑果腺肋花楸多糖可以通过活化Nrf2并上调HO-1的表达减轻衰老脑组织炎症和氧化应激损伤,对神经退行性疾病的改善及治疗提供可能。霍山石斛是一种珍稀中药材,多糖是霍山石斛中最主要的活性成分之一,具有抗氧化功能。有研究报道,霍山石斛多糖可显著上调Nrf2 mRNA和蛋白的表达,促进Nrf2蛋白的核转位,上调NQO1 mRNA的表达［71]。黄芪多糖是黄芪的主要活性成分之一,不仅具有免疫增强、抗肿瘤、抗炎等药理活性,还能有效治疗和改善多种神经系统相关疾病及神经损伤症状,具有良好的神经营养和神经功能增强作用。Qin等［72]通过构建AD小鼠模型,验证了黄芪多糖可以活化Nrf2通路的可行性。随后Sha等［73]在体内外实验中观察到黄芪多糖可以通过增强Nrf2/HO-1信号通路发挥抗炎活性和调节巨噬细胞极化的作用。对于黄芪多糖能否激活Nrf2及下游靶蛋白以改善PD的生理功能,还需要更多数据支持。目前植物多糖类与PD的关联性证据仍较少,未来还需要学者们进行更加深入的研究。

4.4 其他抗氧化活性成分 植物中的酶、肽等蛋白质化合物及生物碱、皂苷、萜类、酯类等生物活性成分也具有抗氧化能力。人参皂苷Rb1属于固醇类化合物,它是人参的主要成分,在中枢神经系统中具有广泛的神经营养和神经保护作用。Li等［74]观察到人参皂苷Rb1在脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)诱导的神经毒性大鼠模型中能减轻多巴胺能神经元损伤。而Peng等［75]做了更深入的研究,他们在细胞实验中观察到抗氧化蛋白Nrf2、NQO1和HO-1的表达明显下调,并增加了细胞质中Keap1的表达,然而用人参皂苷Rb1可逆转此现象。由此证明人参皂苷Rb1能够通过激活Keap1/Nrf2/ARE通路保护神经细胞抗氧化损伤。丹参是一种常见的中药,丹参酮ⅡA是其主要生物活性物质,为二萜醌类化合物,有研究其有抗氧化、抗炎和抗肿瘤作用。Zhang等［76]发现在6-OHDA诱导的PD模型中,丹参酮ⅡA可以促进Nrf2在细胞核内积累,并与ARE序列结合,激活ARE调控的基因表达(HO-1、NQO1、GCLC、GCLM),保护多巴胺能神经元对抗6-OHDA诱导的神经毒性。β-石竹烯是双环倍半萜内酯化合物,其通常存在于许多药用、观赏和食用植物的精油中。有报道β-石竹烯对LPS触发的神经毒性保护作用与Nrf2/HO-1通路相关联［77]。另外,Xu等［78]发现蓝萼乙素(从香茶菜中分离得到的一种二萜化合物)能激活Nrf2/HO-1通路减轻PD大鼠的运动障碍和感觉障碍。小檗碱［79]、青藤碱［80]均为生物碱,是具有神经保护作用的天然化合物,有研究发现两者能通过活化Nrf2/ARE抗氧化信号通路发挥神经保护细胞作用。萝卜硫素是十字花科蔬菜中常见的异硫氰酸酯之一,目前在许多疾病模型中用于抗炎的广泛研究,Tufekci等［81]发现萝卜硫素的细胞保护作用主要与活化Nrf2抗氧化通路相关,其抗氧化机制能否改善PD还仍在研究之中。

5 展望

目前PD发病机制尚不完全清楚,且无根治方法,抗氧化疗法已成为治疗该病有潜力的研究方向。Keap1/Nrf2/ARE通路是参与保护细胞抗氧化损伤的主要信号通路,在细胞及线粒体功能中发挥重要作用。有效激活Nrf2通路,可以上调其下游靶蛋白γ-GCS、GCL、NQO1及HO-1的表达,对多巴胺神经元发挥保护作用,从而达到治疗PD的效果。另外天然植物抗氧化剂能否激活Nrf2途径以保护多巴胺能神经元抗氧化损伤尚在研究之中,研究者们希望能发现更多靶点,结合Keap1/Nrf2抗氧化应激机制,找到预防及治疗PD的最佳有效策略。