指甲-髌骨综合征一家系的遗传学分析并文献复习

刘颖文?张玉鑫?闫露露?韩春晓?李海波

【摘要】目的 分析1个指甲-髌骨综合征（NPS）家系的临床及遗传学特点，为家系的医学遗传咨询和再生育指导提供依据。方法 对先证者及父母DNA行全外显子组测序（WES），并对家系进行Sanger测序和生物信息学验证。以“指甲-髌骨综合征”及“产前诊断”的中英文为检索词，对以下数据库截至2022年12月收录的论文进行检索：PubMed、中国生物医学文献服务系统（SinoMed）、CNKI、万方数据知识服务平台、维普中文科技期刊数据库，收集并分析检索到的NPS患者资料。结果 先证者外周血及胎儿流产组织均存在LMX1B基因c.736C>T （p.Arg246*） 杂合变异，遗传自父亲。该突变为已知的致病性变异。经生物信息学预测，246位氨基酸在不同物种间高度保守，p.Arg246*变异改变了蛋白空间结构，影响蛋白功能。检索文献后收集到6例产前诊断为NPS的病例，均经超声检查和（或）分子遗传学分析明确诊断。结论 LMX1B基因的c.736C>T杂合变异为该NPS家系的致病原因。

【关键词】指甲-髌骨综合征；LMX1B基因；全外显子组测序

Genetic analysis of a pedigree with nail-patella syndrome and literature review Liu Yingwen，Zhang Yuxin，Yan Lulu，Han Chunxiao， Li Haibo. Center for Integrated Prevention and Treatment of Birth Defects， Ningbo Women and Childrens Hospital， Ningbo 315000， China Corresponding author， Li Haibo， E-mail： lihaibo-775@163.com

【Abstract】Objective To analyze the clinical and molecular genetic features in one pedigree with nail-patella syndrome（NPS）， and provide evidence for genetic counseling and reproductive guidance for this family. Methods Whole-exon sequencing （WES）was performed to detect the gene variant of the proband and the whole family. Candidate variants were verified by Sanger sequencing and bioinformatic analysis. Using the key words of “nail-patella syndrome”and “prenatal diagnosis/antenatal diagnosis” as the searching words in both Chinese and English，relevant literatures were searched from PubMed， SinoMed， CNKI， Wanfang Data and Chongqing VIP databases up to December， 2022. Clinical data of NPS cases were collected and analyzed. Results The proband and aborted fetus carried a heterozygous variant c.736C>T （p.Arg246*） of the LMX1B. The same heterozygous variant was found in father rather than in mother. This variant has been proven to be pathogenic. Bioinformatic analysis predicted that the 246th amino acid was highly conserved among different species and p.Arg246* variant altered the structure and function of LMX1B protein. According to literature review， six cases of NPS confirmed by prenatal diagnosis were searched. All cases were diagnosed by ultrasound and/or molecular genetic analysis. Conclusion The heterozygous variant c.736C>T （p.Arg246*） of LMX1B gene is the pathogenic mutation in this NPS pedigree.

【Key words】Nail-patella syndrome； LMX1B； Whole-exon sequencing

指甲-髕骨综合征（NPS）又称为遗传性骨甲发育不良，是一种因LMX1B基因突变导致的常染色体显性遗传病，以指甲畸形、髌骨缺失或发育不全、肘部和髂骨背侧发育不良、肾病和成人青光眼为特征［1］。该病极为罕见，临床表型变异度大，容易漏诊或误诊。本研究对1个NPS家系进行了基因测序和遗传学分析，以明确其致病原因，并检索国内外的相关文献进行分析。

对象与方法

一、NPS一家系临床资料的收集

本科于2021年5月17日诊治了1个NPS家系，收集并分析该家系病史、实验室检查及治疗等资料。本研究获本院伦理委员会批准（EC2010-014）。

二、该家系的分子遗传学分析

抽取先证者及父母外周血行家系及胎儿流产组织全外显子测序和Sanger测序验证，对变异结果行生物信息学预测与蛋白结构分析。

1. DNA提取

采集家系成员外周血及胎儿流产组织，采用QLAGEN QIAamp DNA Mini Kit试剂盒（QIAGEN，德国），提取基因组DNA。将所提取的DNA应用微量紫外分光光度计Nano Drop2000 （Thermo Fisher Scientific，美国）测定浓度，合格后冻存于-20℃备用。

2.全外显子组捕获测序检测

以受检者的基因组DNA为检测材料，利用Roche KAPA HyperExome人全外显子组芯片捕获试剂盒（Roche，瑞士）构建文库，使用MGISEQ-2000（华大基因公司，中国）测序平台进行变异检测。人类基因组参考序列版本选择UCSC hg19人类参考基因组。根据2015年颁布的美国医学遗传学与基因组学学会（ACMG）遗传变异分类标准与指南，评判变异的致病性［2］。

3.变异位点的Sanger测序验证

使用Premier 5.0软件针对LMX1B基因（NM_

002316.3）c.736C>T位点设计引物， 上游引物序列为CCTTCATCACAGGCCGGGTTGT， 下游引物序列为ACGGGGAGATGGTGGGTTTAGG， 对家系基因组DNA进行PCR扩增，扩增产物长度为370 bp。PCR产物通过ABI3500DX genetic Analyzer（Thermo Fisher Scientific，美国）进行测序［3-7］。

4.生物信息学预测与蛋白结构分析

在UCSC网站（http：//www.genomaize.org/）上查询LMX1B蛋白在不同物种间的保守性。在alphafold网站（https：//alphafold.ebi.ac.uk/）下载合适的人类蛋白结构模型［O60663 （LMX1B_HUMAN）］，采用PyMOL2.5软件预测变异对蛋白空间结构的影响。

三、文献检索

以“指甲-髌骨综合征”“产前诊断”“nail-patella syndrome”“prenatal diagnosis/antenatal diagnosis”为检索词，对以下数据库截至2022年12月收录的论文进行检索：PubMed、中国生物医学文献服务系统（SinoMed）、CNKI、万方数据知识服务平台、维普中文科技期刊数据库，收集并分析检索到的NPS患者资料。

结果

一、NPS一家系的病历资料

1.入院主诉及检查

孕妇，39岁，孕3产1，孕23+2周时因“外院产前超声检查提示胎儿双足内翻”于2021年5月12日到本院产前诊断门诊就诊，复查产科超声提示胎儿双足内翻，见图1A。临床医师推荐患者于2021年5月17日到本科就診。孕妇曾生育1女，现7岁，体格检查发现其行走姿势呈“外八字”，双手指甲发育不良，发育不良程度由拇指至小指依次减轻，大拇指指甲缺失，双足指甲发育尚可，见图1B，该患儿在宫内超声检查时即已发现“双足内翻”，当时向临床医师咨询后，孕妇及家属决定继续妊娠。患儿于2018年3月16日足月顺产娩出，出生时其双足内翻，余未见明显异常。基于当时基因测序技术普及率不高，故未行基因检测。患儿出生1个月曾于外院行双足内翻矫正手术，效果尚可，但行走姿势仍呈“外八字”。详询家系成员情况，患儿父亲存在与女儿相似的双手指甲异常表现，且双手手指存在因近端关节过度拉伸和远端关节过度屈曲而形成的“天鹅颈样”畸形，左手无名指、右手食指中指及无名指末节指间关节指纹消失，见图1C。家系成员发病情况见图1D。由于年限、家庭经济等多方面原因，该家系的部分相关资料丢失，信息不全。

2.诊断及确诊过程

结合家系患者现有表型，并查阅骨骼异常文献资料，疑诊胎儿患NPS，经咨询后，孕妇及家属决定终止妊娠，流产胎儿外观显示双足姿势异常。继续采集家系成员外周血及胎儿流产组织行全外显子测序及Sanger测序验证，以明确遗传学病因。所有受检者对上述检测知情并签署知情同意书。

3.全外显子测序及Sanger测序验证结果

家系全外显子测序及Sanger验证发现先证者与流产胎儿组织均存在LMX1B基因第4号外显子的c.736C>T （p.Ar g246*） 杂合突变，遗传自表型异常的父亲，见图1E。依据ACMG遗传变异分类标准与指南，该突变为致病突变（ACMG： PVS1+PM2+PP4）。经检索Human Gene Mutation Database数据库，确定为已报道的致病突变。

4.生物学信息预测

在UCSC网站（http：//www.genomaize.org/）上查询LMX1B蛋白第246位氨基酸位点在人类、鼠、狗、鸡、斑马鱼等物种间的蛋白保守性，结果提示LMX1B蛋白第246位氨基酸位点在不同物种间高度保守，见图1F。c.736C>T （p.Arg246*）突变导致LMX1B蛋白翻译提前终止，生成截短的LMX1B蛋白，蛋白结构预测提示，p.Arg246*突变改变了蛋白空间结构，影响蛋白功能，见图1G～H。

二、文献检索结果

收集到产前诊断为NPS的病例共6例，均经超声检查和（或）分子遗传学分析明确诊断，6例的临床资料见表1。

讨论

NPS的典型临床表现为涉及指甲、骨盆、膝关节、肘关节的四联畸形，除此之外，还存在眼部和肾脏受累的表现［1］。指甲缺失/发育不良是NPS最恒定的特征，几乎所有的患者均存在指甲受累的情况。骨骼异常主要包括骨关节的发育不良及脱位、足部内/外翻畸形。其中，手指关节可因近端关节过度拉伸和远端关节过度屈曲而形成“天鹅颈样”畸形；髂骨后部形成的三角形骨隆起物称为“髂骨角”，被认为是NPS的特征性病变。眼部异常较为少见，表现为青光眼、视网膜色素异常等。肾脏病变是NPS最严重的表现，可从轻微血尿、蛋白尿发展到肾衰竭。由于NPS临床表现变异度大，症状在同一家庭成员之间也可能不尽相同，因此临床医师需告知患者各类疾病发生风险的可能性，完善相关检查，并定期检测。

1998年，Vollrath等［3］通过测序技术确定了LMX1B基因功能缺损为NPS的致病原因。LMX1B位于9q34，包含8个外显子，编码LIM同源结构域蛋白家族转录因子，是一种由379个氨基酸组成的高度保守蛋白质，对维持背侧肢体、肾小球基底膜、眼睛前段和神经元的发育起重要作用［4］。该蛋白质主要包括2个结合DNA的LIM结构域（LIM-A、LIM-B）及一个结合蛋白的同源结构域。目前已经报道了180多种（https： //www.hgmd.cf.ac.uk/ac/search.php）LMX1B致病突变，80%的突变位于LIM域，20%位于同源域，主要包括单核苷酸变异和基因缺失/插入。尽管NPS的肾外症状没有明显的基因型-表型关联，但据报道，与携带LIM域突变的患者相比，具有同源域内LMX1B突变的患者出现蛋白尿的频率明显增高［5］。

本研究通过全外显子测序及Sanger测序验证发现先证者、先证者父亲和流产胎儿均携带相同的LMX1B基因c.736C>T（p.Arg246*）杂合突变，为已知的致病突变，且先证者的临床表型也与NPS的典型表型一致。有研究者曾报道过1例存在c.736C>T新发杂合突变的患者，其具有典型的NPS临床表型：指甲发育不良，肘部僵硬、伸展受限，髌骨及髂骨畸形，眼部及肾脏未见异常［6］。c.736C>T位于LMX1B基因同源结构域，氨基酸保守性分析显示246位氨基酸在不同物种中高度保守（http：//www.genomaize.org/）。该突变使246位的精氨酸变为终止密码子，导致截短蛋白形成，影响LMX1B蛋白功能，从而引起NPS的相关症状。Sasidharan等［7］在1个7日龄的NPS男性患儿中发现LMX1B的4号外显子c.691C>T， （p. Arg231Ter） 无义突变，该突变也位于LMX1B基因同源结构域，这也再次说明了LMX1B基因同源结构域对维持其蛋白功能的重要性。

既往报道的NPS病例大多数于出生后才被诊断，产前诊断为NPS的仅6例［6，8-12］。其中5例产前超声检查均提示足内翻/肢体运动受限/长骨畸形等骨骼异常，并且均有家族史，1例因产前绒毛基因检测发现LMX1B的c.750+1G>A突变，故直接于孕15周引产。Drut等［13］发现了1例18周自然流产胎儿的肾脏出现病理变化，肾小球超微结构检查显示其肾小球和系膜毛细血管壁增厚，基底膜不规则增厚，由此他们提出通过宫内肾活组织检查辅助产前诊断NPS。但鉴于实施胎儿宫内肾穿刺存在高风险，因此宫内肾活组织检查未被用于诊断NPS。Feingold等［8］曾提出可在孕36周时通过超声检查显示髂骨角来诊断胎儿NPS。上述分析显示，NPS患者孕中期超声检查显示足内翻/肢体运动受限/长骨畸形等骨骼异常概率较高，因此产前超声检查显示骨骼异常合并家族指甲及骨骼异常疾病史时，临床医师需提高警惕，及时进行产前诊断以明确是否为NPS。目前NPS的诊断方法为依据患者表型联合基因检测，推荐全外显子测序检测方法。如果基因测序不能诊断，但临床怀疑NPS并观察到显性遗传模式，则可以考虑是否存在因LMX1B基因倒置而干扰LMX1B基因功能的可能性［14］。在治疗方面，NPS暂无有效的治疗方法，只能对症支持治疗，骨骼问题可选择物理治疗或者手术，肾脏异常可使用ACEI控制血压和减缓蛋白尿的进展，并应进行定期监测。

本研究通过全外显子测序和Sanger测序技术明确了LMX1B基因c.736C>T（p.Arg246*）雜合突变为该家系的致病原因，丰富了中国人群LMX1B基因突变所致的NPS突变谱和表型谱，为家系的遗传咨询和再生育指导提供了依据。

参 考 文 献

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（收稿日期：2022-08-23）

（本文編辑：洪悦民）