马桑香菇液体菌种发酵条件的研究

熊 雪，万丽英，向 准，李 鹏*，黄 静，和耀威

（1.贵州省生物研究所，贵州 贵阳 550009；2.贵州省食用菌产业体系，贵州 贵阳 550006；3.六盘水职业技术学院，贵州 六盘水 553001）

香菇(Lentinula edodes)属担子菌门(Basidiomycota)、伞菌纲(Agaricomycetes)、伞菌目(Agaricales)、小皮伞科(Marasmiaceae)、香菇属(Lentinula)［1］。香菇清香可口，含有丰富的维生素和氨基酸，具有良好的保健功能［2-3］；香菇人工栽培已经遍布全国，且品种繁多，市场占有率高。我国野生香菇资源丰富，主要分布在华南、华中、西南地区，大多数野生香菇较普通香菇更为鲜香［4］。马桑香菇是一种香味浓郁、口感独特的野生香菇，其香气成分及氨基酸含量均远高于一般香菇，检测发现其香气成分达85种，氨基酸种类有17种［5-6］；马桑香菇最早被发现于贵州省黔北地区的灌木林中［7］，是贵州特有的野生香菇资源，现已通过自然选育实现了人工栽培。但是在马桑香菇的生产栽培中主要采用固体菌种，且菌棒市场价格高达8元/棒，大大限制了马桑香菇产业的发展。固体菌种在生产实践中具有成本高、效率低、周期长等特点［8］，在大规模生产中其整体性价比不如液体菌种。周峰等［9］通过研究发现，使用液体菌种，以日产4万个香菇菌棒为例，每年节省的菌种费用达100多万元；使用液体菌种还具有接种方便、生产周期短、能耗低、库房使用率高、出菇质量佳等优点［10-11］。马桑香菇是香菇中的后起之秀，其配套栽培技术尚未成熟，在液体菌种发酵方面的研发更是空白。鉴于此，本试验从温度、酸碱度、矿物质、碳源、氮源等方面探索了马桑香菇液体菌种发酵的最优配方，以期缩减马桑香菇菌种生产的成本与时间，进一步促进马桑香菇标准化、规模化生产。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

供试马桑香菇菌株由贵州省生物研究所分离驯化所得，现保藏于贵州省生物研究所。

1.2 培养基

活化培养基：马铃薯（去皮）200 g，葡萄糖10 g，蔗糖10 g，蛋白胨2 g，酵母膏2 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，维生素B110 mg，琼脂粉20 g，去离子水1000 mL。

液体种子培养基：马铃薯（去皮）200 g，葡萄糖10 g，蔗糖10 g，蛋白胨2 g，酵母膏2 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，维生素B110 mg，去离子水1000 mL。

基础培养基：葡萄糖20 g，蛋白胨2 g，KH2PO41 g，维生素B110 mg，去离子水1000 mL。

1.3 试验方法

1.3.1 菌种活化 将保存的马桑香菇菌株接种于活化培养基上，在25 ℃恒温下活化10 d。取活化的平板，使用打孔器打取直径为5 mm的接种物；然后向100 mL液体种子培养基中接入5个接种物，在25 ℃下以150 r/min的转速在摇床上避光培养；培养12 d后，用匀浆机将三角瓶内的菌丝球搅拌30 s，使其成均质体，备用。

1.3.2 温度筛选试验 在盛有100 mL液体种子培养基的三角瓶中接入10 mL马桑香菇种子液，每个处理3次重复。接种后分别在15、18、20、23、25、28、30 ℃温度下，以150 r/min的转速培养8 d，最后进行菌丝球直径和干重的检测。

1.3.3 酸碱度筛选试验 在无菌环境下，在盛有100 mL液体种子培养基的三角瓶中，将pH值分别调至5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，并接入10 mL马桑香菇种子液，每个处理3次重复。于25 ℃、150 r/min条件下培养8 d，最后进行菌丝球直径和干重的测定。

1.3.4 矿物质优化试验 以基础培养基中矿物质(KH2PO4）为对照，分别加入矿物质K2HPO4、MgSO4、KCl、NaCl、CaCl2、ZnSO4、FeSO4及 CuSO4，定容至1000 mL，121 ℃灭菌30 min。然后在盛有100 mL培养液的三角瓶中接入10 mL马桑香菇种子液，每个处理3次重复。于25 ℃、150 r/min条件下培养8 d，最后进行菌丝球直径和干重的测定。

1.3.5 碳源优化试验 以基础培养基中碳源（葡萄糖）为对照，分别加入等量的果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、可溶性淀粉、糊精、甘露醇及麦芽浸粉，定容至1000 mL，121 ℃灭菌30 min。其余操作同1.3.4。

1.3.6 氮源优化试验 以基础培养基中氮源（蛋白胨）为对照，分别加入等量的KNO3、尿素、玉米浆、豆粕粉、(NH4)NO3、酵母浸粉、谷氨酸、酵母膏及麦麸，定容至1000 mL，121 ℃灭菌30 min。其余操作同1.3.4。

1.3.7 通过正交试验对液体培养的主要碳、氮源进行筛选 以上述温度、酸碱度、碳源、氮源以及矿物质的单因素试验结果为依据，采用L9（34）正交表进行四因素三水平正交试验。以培养基CaCl20.5 g+K2HPO40.5 g+维生素B110 mg+去离子水1000 mL（pH值为7.5）为基础，选取2个适宜碳源（葡萄糖和乳糖）、2个适宜氮源（豆粕粉和玉米浆）作为试验的4个因素，每个因素设计3个水平（表1），组合成含有不同碳源和氮源的供试培养基，得到9个试验处理组，每组3个重复。其余操作同1.3.3。

表1 马桑香菇液体菌种正交试验因素水平 g/L

1.3.8 马桑香菇液体菌种最佳配方的验证试验 经正交试验，得到马桑香菇液体菌种培养基的最优配方：葡萄糖30.0 g，乳糖5.0 g，豆粕粉4.0 g，玉米浆4.0 g，CaCl20.5 g，K2HPO40.5 g，维生素B110 mg，去离子水1000 mL（pH值7.5）。根据上述最优配方配制液体菌种培养基，在121 ℃下灭菌30 min；然后于25 ℃、150 r/min条件下培养9 d，从培养后第2天开始，每天进行1次菌丝干重及脱氢酶活力的检测。验证试验重复3次，取平均值。

1.4 项目测定及数据处理

1.4.1 菌丝球直径的测定 随机取30个菌丝球，在平板上排成1排，测定总长度，计算出单个菌丝球的直径；共测量3次，取平均值。

1.4.2 菌丝球干重的测定 取100 mL发酵液，用8层纱布过滤，获得菌丝球；用蒸馏水洗涤菌丝球3次，然后置于80 ℃鼓风干燥箱中烘干，称其质量，即菌丝球干重（g/100 mL）。

1.4.3 菌丝脱氢酶活力的测定 本试验应用TTC-脱氢酶还原法［12］测定马桑香菇的菌丝活力。在一定温度下，单位时间内形成的TF量定义为1个酶活力单位，其计算公式为：

上式中：U为酶活力［μg/(mg·h)］；CTF为生成的TF浓度(μg/mL)，从标准曲线查得；V2为萃取剂的体积(mL)；C1为菌液的浓度(mg/mL)；V1为菌液的体积(mL)；t为反应时间(h)。

2 结果与分析

2.1 温度对马桑香菇菌丝生长的影响

在所有供试温度条件下马桑香菇菌丝球均呈淡黄色刺状球形，大小较为均匀。菌丝干重随着培养温度的升高而呈缓慢的先增后减趋势（图1），在15 ℃下菌丝干重明显低于其他温度下的，只有0.38 g/100 mL，其次为30、18 ℃下的；25 ℃下的菌丝干重最大（0.63 g/100 mL），显著高于30、15 ℃下的，但与18、21、23、28 ℃下的差异不显著。菌丝球直径随温度升高呈现“M”形变化，2个峰值分别出现在18和28 ℃下。说明在供试温度范围内，马桑香菇液体菌种在21~25 ℃下的菌丝球较小且多，即马桑香菇液体菌种发酵的适宜温度为21~25℃，最佳温度为23~25 ℃。

图1 在不同培养温度下马桑香菇菌丝的生长情况

图2 在不同pH值条件下马桑香菇菌丝的生长情况

2.2 酸碱度对马桑香菇菌丝生长的影响

在供试酸碱度范围内，菌丝球均呈淡黄色刺状球形，大小较为均匀，当pH值为6.0时，菌丝球长势最好，大小均匀度最高。当pH值为6.5时，菌丝球干重最大，达0.647 g/100 mL；其次为pH值6.0、7.0；而当pH值为9.0时，菌丝球干重最小，只有0.573 g/100 mL，显著低于pH值6.0~7.0下的。菌丝球直径在pH值6.5下显著大于其他pH值条件下的；当pH值达到9.0时菌丝球直径最小(3.5 mm)，显著小于其他酸碱度条件下的；除了pH值6.5、9.0外，在其他6个pH值条件下菌丝球直径差异不显著，说明马桑香菇菌丝对酸碱度的适应能力强，在供试酸碱度范围内均能较好地生长。结合菌丝长势可知，马桑香菇液体菌种发酵培养的适宜pH值为6.0~7.0，且以pH值6.0为最佳。

2.3 矿物质对马桑香菇菌丝生长的影响

如表2、图3所示，马桑香菇液体菌种在培养中菌丝生长受培养基中矿物质的影响较大，在不同矿物质添加条件下菌丝形态差异较大，但菌丝球直径整体偏大，在不同矿物质条件下差异不显著。在所有供试矿物质中，添加CaCl2和K2HPO4有助于马桑香菇菌丝的生长，菌丝干重分别达到了0.41和0.33 g/100 mL，且菌丝球数量多于其他矿物质条件下的。其次为添加MgSO4和KH2PO4处理，菌丝干重分别达到了0.31和0.30 g/100 mL。在添加矿物质CuSO4的条件下培养，菌丝干重最低（0.08 g/100 mL），且菌丝球少，大小不均匀，长势差。综上可知，在供试的矿物质中，添加CaCl2和K2HPO4能更好地促进马桑香菇的菌丝生长，MgSO4和KH2PO4次之。

图3 在不同矿物质添加条件下马桑香菇菌丝的生长情况

表2 在不同矿物质添加条件下马桑香菇菌丝的生长情况

2.4 碳源对马桑香菇菌丝生长的影响

如表3、图4所示，当以糊精为碳源时，马桑香菇菌丝干重显著大于其他碳源培养的，其次为葡萄糖、麦芽浸粉和甘露醇；当碳源为可溶性淀粉、乳糖、果糖、麦芽糖、蔗糖时，菌丝干重均较小，且彼此间差异不显著。当以糊精、麦芽浸粉为碳源时，菌丝球直径显著大于其他碳源培养的；以糊精为碳源时菌丝球大小不均匀，培养液较为浑浊；当以葡萄糖、果糖和乳糖为碳源时，菌丝球直径小，数量较多且大小较为均匀，其中以乳糖为碳源时马桑香菇菌丝的整体长势最好。因此，在供试碳源中，马桑香菇液体菌种发酵培养以乳糖、葡萄糖及果糖更为适宜。

图4 不同碳源培养下马桑香菇菌丝的生长情况

表3 在不同碳源培养下马桑香菇菌丝的生长情况

2.5 氮源对马桑香菇菌丝生长的影响

如表4、图5所示，马桑香菇在10种供试氮源培养下均能正常生长，但菌丝的长势有差异。当以豆粕粉、麦麸为氮源时，马桑香菇的菌丝干重显著高于其他氮源培养的，分别达0.49和0.39 g/100 mL；在这2种氮源培养条件下，菌丝球直径也显著大于其他氮源培养的，分别达6.91和6.66 mm，且菌丝球数量多，但菌丝球大小均匀度不够。当以尿素为氮源时，菌丝球数量最少，直径最小且干重最低，说明马桑香菇对氮源尿素吸收不良。当以硝酸钾和谷氨酸为氮源进行培养时菌丝球干重略高于氮源尿素培养的，但在0.05水平上差异不显著，且菌丝球数量较多、较均匀。当以蛋白胨、玉米浆、硝酸铵、酵母浸粉、酵母膏为氮源进行培养时，菌丝球干重在0.05水平上差异不显著，其中以硝酸铵、酵母浸粉为氮源进行培养时菌丝球数量较少，以玉米浆、酵母膏为氮源进行培养时菌丝球数量多，以玉米浆为氮源培养时菌丝球大小最均匀。综合而言，马桑香菇对有机氮蛋白胨、玉米浆、豆粕粉、酵母浸粉、酵母膏和麦麸的吸收情况优于无机氮硝酸钾、尿素和硝酸铵的，且马桑香菇液体菌种发酵培养的最适氮源为豆粕粉、麦麸和玉米浆，其中以玉米浆最佳。

图5 在不同氮源培养下马桑香菇菌丝的生长情况

表4 在不同氮源培养下马桑香菇菌丝的生长情况

2.6 正交试验结果分析

选取适宜的碳源（乳糖、葡萄糖）和适宜的氮源（玉米浆、豆粕粉）建立 L9（34）正交表，进行四因素三水平的正交试验，发现马桑香菇在9个碳氮源配方中均能较好地生长，菌丝球为刺状球形，数量多，大小均匀度高，菌丝球直径小，且各配方处理的菌丝球直径在0.05水平上无显著差异（表5和图6）。在Y7配方下，马桑香菇的菌丝球干重明显高于其他配方的，达0.86 g/100 mL，说明在供试的9种碳氮浓度配方中，Y7（A3B1C3D2）配方中的碳、氮源最适于马桑香菇的吸收利用。

图6 在不同碳、氮浓度下马桑香菇菌丝的生长情况

表5 在不同碳、氮浓度下马桑香菇菌丝的生长情况

对4个因素进行主体间效应的检验分析，结果（表6）表明：PB＜PD＜PA＜PC，且因子B（乳糖）和因子D（玉米浆）对菌丝干重有极显著的影响（P＜0.01），而因子A（葡萄糖）和因子C（豆粕粉）对菌丝干重影响不显著。

表6 马桑香菇正交试验主体间效应的检验结果

从表7可以看出，4个因素的R值表现为RB＞RD＞RC＞RA，表明4个因素对马桑香菇菌丝干重的影响力度次序为B（乳糖）＞D（玉米浆）＞C（豆粕粉）＞A（葡萄糖），该结果与表6所得结果基本一致。按照各因素的最优水平，得到A3B1C1D3组合为本试验的最优碳氮配方组合，即葡萄糖30.0 g+乳糖5.0 g+豆粕粉1.0 g+玉米浆4.0 g。但该组合并不在试验处理中，故需要进行验证试验。

表7 碳、氮源对马桑香菇菌丝生长影响的正交试验分析结果

2.7 马桑香菇液体菌种培养最优配方的验证

采用上述正交试验所得的最优配方，进行验证试验。结果显示：马桑香菇菌丝随培养时间的增加而累积，菌丝球干重在培养前期增加迅速，培养5 d后开始趋于平缓，但未出现减少情况，最大菌丝干重达0.88 g/100 mL（图7）。TTC-脱氢酶活力随培养时间的增加而呈现先增加后减少的趋势，且在培养后第4 天达到峰值［292.15 μg/(mg·h)］。说明该优化配方中的碳、氮源能被马桑香菇较好地吸收利用，采用该配方能缩短马桑香菇菌种的培养时间。

图7 马桑香菇液体菌种发酵培养中菌丝球干重及菌丝脱氢酶活力的变化

3 讨论与小结

自1948年美国的Humfeld［13］揭开食用菌液体发酵研究的序幕后，液体菌种发酵技术随着食用菌产业的蓬勃发展而得到了快速的推广，在多种食用菌规模化、工厂化栽培中逐步取代了传统固体菌种培养模式，如香菇、平菇、金针菇、杏鲍菇、虫草、黑木耳及草菇等［14-20］。与固体菌种相比，采用液体菌种不但可以降低成本、缩短周期，还具有接种方便、污染率低、萌发点多、生长快、出菇整齐、成品率高等优点［11］，因此采用液体菌种是香菇大规模生产的发展趋势。马桑香菇是一种极受欢迎的野生鲜香食用菌，开发价值高。虽然目前已实现人工栽培，但马桑香菇菌棒成本高、周期长、产量低的瓶颈仍有待破解。本试验结果显示，马桑香菇液体菌种发酵的最佳温度为23~25 ℃，适宜pH值为6.0~7.0，最适矿物质为CaCl2和K2HPO4，最佳碳源为乳糖、葡萄糖、果糖，最佳氮源为豆粕粉、麦麸、玉米浆。马桑香菇液体菌种对温度的适应性与其他香菇菌株大体相当［21-22］；本试验研究结果与熊雪等［23］对马桑香菇菌丝在固体平板上的生长条件研究结果较为一致。香菇菌丝适于在酸性环境下生长，菌丝一般在pH值4.0~5.5条件下生长最佳［24-25］，而马桑香菇菌丝生长更倾向于弱酸性和中性环境。马桑香菇在固体平板培养时最佳碳、氮源分别为蔗糖和蛋白胨［23］；但在本试验的液体发酵培养中，马桑香菇对这2种物质的吸收能力一般，对单糖碳源的吸收能力更强；相对于无机氮源，豆粕粉、玉米浆、麦麸、酵母膏等有机氮源无论是在固体平板还是在液体发酵培养下均能被更好地分解和吸收，而氮源尿素则很难被马桑香菇吸收，这可能是因为豆粕粉、玉米浆、麦麸、酵母膏等复杂有机氮还可以作为碳源被利用，有利于香菇的营养平衡及物质转化［26］。香菇液体菌种发酵技术已日渐成熟，很多学者对国内市场上不同香菇菌株液体发酵培养的适宜配方进行过筛选。例如：徐思炜等［27］通过试验筛选，确定了香菇液体菌种培养的优势碳、氮源分别为麦芽糖与麦麸；王红等［28］在对香菇液体菌种配方的研究中确定了优势碳、氮源分别为碳源红糖、蔗糖和氮源麦麸、牛肉膏；覃宝山等［29］在对香菇液体菌种发酵培养基主要营养物质筛选及培养条件的优化试验中筛选出最优碳、氮源分别为葡萄糖和蛋白胨；鹿桂花等［30］对武香一号香菇液体菌种的摇瓶发酵工艺进行了优化，得出优势碳、氮源分别为碳源麦芽糖、葡萄糖和氮源酵母浸粉、牛肉膏；谢婷等［31］在对香菇“森源16”菌株液体菌种培养基及摇瓶培养条件优化的研究中确定了该菌株的最佳碳、氮源分别为棉秆粉和麸皮；李春霞等［24］在对香菇0912液体菌种培养基及摇瓶发酵条件的筛选中发现碳源葡萄糖和氮源玉米浆、麦麸更易被吸收。由于各试验的香菇菌株以及供试碳、氮源均有所差异，因此所得结果也有所不同，但整体而言，大多数香菇菌株都能较好地吸收利用碳源葡萄糖和氮源麦麸。周韬［32］也证实了香菇L808液体菌种能较好地吸收氮源麦麸，但氮源豆粕粉较麦麸更能促进该菌种菌丝生物量的积累，这与本研究马桑香菇培养的氮源选择结果相近。

经过正交试验分析，本研究得到了马桑香菇液体菌种发酵培养的最优配方：葡萄糖30.0 g，乳糖5.0 g，豆粕粉1.0 g，玉米浆4.0 g，CaCl20.5 g，K2HPO40.5 g，维生素B110 mg，去离子水1000 mL（pH值为6.0）。在该配方下马桑香菇菌丝球小而多，且所耗碳、氮源成本低，生产方便；合理应用该配方能缩减马桑香菇制种和制棒的时间和成本，有助于加快液体菌种产业制种工艺的转型升级，从源头上解决制约马桑香菇产业标准化、规模化的瓶颈问题，从而推进马桑香菇产业的快速发展。