养殖场常用消毒剂对非洲猪瘟病毒核酸的影响

王苗利，薛瑞雪，李玉杰，李金明，李云岗*

[1.山东省动物疫病预防与控制中心(山东省人畜共患病流调监测中心），山东济南 250100；2.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032]

非洲猪瘟 (African swine fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒 (African swine fever virus，ASFV）引起的一种高度接触性传染病，致死率可高达100%[1]，严重影响我国生猪产业健康发展。该病可通过多种方式传播，直接接触、间接接触及短距离的气溶胶均可在猪群传播，同时也可在在家猪-野猪-软蜱-家猪间循环传播[2]。但目前尚无针对ASFV 的商品化疫苗[3]，检疫、剖杀及合理的生物安全措施是防控该病的主要手段，其中生物安全措施中的消毒环节便成为养殖过程中的重中之重。

有效的消毒可直接阻断病毒的传播，是防控ASFV 传播的关键。常见的消毒方法主要包括化学消毒、物理消毒和生物消毒3 大类，这些消毒方式中化学消毒的方式使用较多[4]。为做好ASF 防控工作，在现场消毒后，需评估消毒效果，其中最常用的方法为荧光定量PCR 方法，而当前建立的ASFV 微滴式数字PCR 方法更能直观地显示消毒剂对病毒核酸降解能力[5]。本研究拟用微滴式数字PCR 方法检测醛类、季铵盐类、过氧化物类等6 类9 种常用消毒剂与ASFV 阳性样品作用后核酸产物的含量，评估不同消毒剂对ASFV 核酸降解能力，以期科学评价消毒剂在ASF 防控实践中的消毒效果并提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

消毒剂：购买市面常见的醛类(戊二醛、戊二醛癸甲溴铵）、季铵盐类(癸甲溴铵）、过氧化物类(过硫酸氢钾、过氧乙酸）、酶制剂 (莱芙酶）、含氯类(月苄三甲氯铵、二氯异氰脲酸钠、次氯酸）、含碘类(聚维酮碘）等6 类消毒剂。所有消毒剂均可用于畜禽舍栏运载工具、器具消毒；皮肤和黏膜消毒。消毒剂产品详细信息见表1，所用产品均注册有兽药产品批准文号，试验时均在有效期以内。

表1 消毒剂产品信息汇总

主要试剂：磁珠法病毒DNA/RNA 提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；Probe dPCR SuperMix 及微滴数字PCR 相关试剂购自北京新羿生物。

主要仪器：仪器TISSUELYSER II 组织研磨仪由Qiagen生产，微滴式数字PCR 仪由新羿生物公司生产。

组织样品：ASFV 阳性组织样品来自于中国动物卫生与流行病学中心。

1.2 方法

1.2.1 消毒剂与病毒液混合液的制备

取ASFV 阳性组织样品研磨离心后取上清液，加入磷酸缓冲盐溶液制备10 倍病毒稀释液备用。参考农业农村部文件《关于在非洲猪瘟防控中做好消毒剂选择工作的通知》 (农牧便函〔2019〕 735 号），以有效灭活ASFV 为目的，按照消毒剂说明书标明浓度范围合理选择工作浓度，制成10 倍工作浓度备用。将0.2 mL 10 倍病毒稀释液和0.2mL 消毒液加入到1.6mL 磷酸缓冲盐溶液中充分混匀。无法制成10 倍工作浓度液的消毒剂，按照1∶2 工作浓度，即将1mL 消毒剂原液和0.2mL 10 倍病毒稀释液，加入到0.8mL 磷酸缓冲盐溶液中充分混匀。阳性对照组，直接将0.2mL 10 倍病毒液加入1.6mL磷酸缓冲盐溶液中充分混匀；阴性对照组，直接取1mL 磷酸缓冲盐溶液。

1.2.2 核酸提取液制备

消毒剂与不同浓度ASFV作用产物制备：取ASFV 阳性组织样品研磨离心后取上清，用磷酸缓冲盐溶液制成10、100、1000 倍病毒稀释液，参照1.2.1 方法制备消毒剂与病毒液混合液，室温条件下(20～25℃）作用30min。

消毒剂与ASFV 不同作用时间作用产物制备：按照1.2.1方法制备得到的消毒剂与病毒液混合液，室温条件下(20～25℃）分 别作 用5、10、20、30 和40min。

消毒剂与ASFV 不同作用温度产物制备：按照1.2.1 方法制备得到的消毒剂与病毒液混合 液，分别于4℃、25℃和35℃温度条件下作用30min。

阴、阳性对照样品均按照相同条件作用处理。

1.2.3 病毒核酸提取

取200μL 上述作用后产物，按照DNA/RNA 提取试剂盒说明进行操作，提取后的核酸保存于-80℃冰箱备用。

1.2.4 数字PCR 扩增

数字PCR 反应体系：2×SuperMix 10μL，上游引 物(10μmol/L）、下游引 物(10μmol/L）各1.8μL，探 针(10μmol）0.05μL，DNA 模板2μL，用ddH2O 补齐至20μL。普 通PCR 反应条 件：95℃10min；94℃30s，60℃1min，40 个循环；4℃60min，升降温速率2℃/s。

1.2.5 检测结果分析

重复处理各组样品3 次并检测，统计平均检测值，将各组检测结果分别与对应阳性对照组比较。

2 结果

2.1 各消毒剂与不同浓度ASFV 作用结果

各消毒剂在选定稀释度下与不同浓度的ASFV 在室温条件下作用30min 后，采用微滴式数字PCR 进行检测。处理样品平行检测3 次，各组平均阳性微滴数批间变异系数为0.42%～5.91%；取同一批次样品平行提取核酸3 次进行检测，各组平均阳性微滴数批内变异系数为0.15%～2.19%。

结果显示，与阳性对照相比，本研究中不同浓度的AS-FV 与二氯异氰尿酸钠作用后核酸降解量最大，病毒核酸含量由17489.2 降为10.1，当病毒核酸含量为1743.2 时，与该消毒剂作用后检测不到病毒核酸；10 倍稀释的病毒液分别与戊二醛和过硫酸氢钾消毒剂作用后，检测的病毒核酸含量降低约100 倍，当病毒进行100 倍稀释后，这两组均未检测到病毒核酸；10 倍稀释的病毒液分别与过氧乙酸和聚维酮碘作用后，检测病毒核酸降低约0.4 倍；病毒与其他种类消毒液作用后，病毒核酸降解量相对不明显(表2）。

表2 组织样品微滴式数字PCR 检测结果

2.2 各消毒剂与ASFV 不同作用时间结果

各消毒剂在选定稀释度下与原始病料样品1.7×104copies的ASFV 分别作用5、10、20、30 和40min 后，采用微滴式数字PCR 进行检测。处理样品平行检测3 次，各组平均阳性微滴数批间变异系数为0.36%～5.42%；取同一批次样品平行提取核酸3 次进行检测，各组平均阳性微滴数批内变异系数为0.17%～2.26%。结果显示戊二醛与ASFV 作用时间不同，对病毒的核酸降解量变化最大。其他种类消毒剂对ASFV 核酸降解量并未随着时间的延长而有明显增加(图1）。

图1 消毒剂与ASFV 不同作用时间病毒拷贝数

2.3 各消毒剂与ASFV 作用温度结果

各消毒剂在选定稀释度下与原始病料样品1.7×104copies的ASFV 分别在4、25 和35℃条件下作用30min 后，采用微滴式数字PCR 进行检测。处理样品平行检测3 次，各组平均阳性微滴数批间变异系数为0.32%～5.39%；取同一批次样品平行提取核酸3 次进行检测，各组平均阳性微滴数批内变异系数为0.20%～2.47%。结果显示过硫酸氢钾和戊二醛癸甲溴铵与ASFV 作用在温度较高时，消毒剂对核酸的降解量增加较明显。其他种类消毒剂对ASFV 核酸降解量并未随着环境温度的变化而有明显变化 (图2）。

图2 消毒剂与ASFV 不同作用温度病毒拷贝数

3 讨论

ASFV 严重危害猪只健康，且目前尚无商品化疫苗。消毒是控制病毒感染的重要环节，ASFV 对戊二醛、含氯、含碘类等多数常用消毒剂敏感[6]。通常，病毒分离方法最能直观显示消毒剂对病毒的杀灭效果，但该方法只能在农业部指定实验室中开展，且检测周期长、操作繁琐，不适用于快速监测。而ELISA 和胶体金等检测方法敏感性较低，达不到对消毒效果评价要求[7]。数字PCR 方法可对病原含量进行定量，且灵敏度高于荧光定量PCR 方法。

该研究通过微滴式数字PCR 检测结果显示，含氯类中二氯异氰尿酸钠、醛类中戊二醛、过氧化物中过硫酸氢钾3类消毒剂与ASFV 作用后，对数字PCR 检测结果影响最显著，病毒核酸含量明显下降。有研究显示，二氯异氰尿酸钠与水作用后可产生次氯酸，引起蛋白变性从而改变膜的通透性，同时也能影响DNA 合成等来杀灭病原[8]。但该研究中另一含氯类消毒产品，与ASFV 作用后，对病毒核酸影响很小。因此不同含氯类消毒剂对病毒核酸影响差异的原因，需进一步研究分析。戊二醛类消毒剂，能够凝固蛋白质中的氨基和羧基导致病原微生物蛋白变性使其死亡[9]。本研究发现戊二醛有显著的核酸降解能力，而戊二醛癸甲溴铵对核酸的降解能力较弱，且季铵盐类消毒剂癸甲溴铵与ASFV 作用后，核酸含量无明显变化，推测可能癸甲溴铵不仅不具有核酸降解能力，而且会抑制戊二醛对病毒核酸的降解能力。

4 结论

综上所述，二氯异氰尿酸钠、戊二醛、过硫酸氢钾这3种消毒剂相对于其他消毒剂对病毒核酸降解量最大；戊二醛与非洲猪瘟病毒作用时间不同，对病毒的核酸降解量变化最大；环境温度对过硫酸氢钾和戊二醛癸甲溴铵的非洲猪瘟病毒核酸降解能力影响最大，温度较高时，核酸降解能力增强。提示了养殖场如若消除病毒核酸污染，可选择二氯异氰尿酸钠、戊二醛、过硫酸氢钾这3 种消毒剂，且在使用过程中，戊二醛尽可能增加消毒作用时间，过硫酸氢钾适当提高消毒作用温度，来加强病毒核酸降解能力。