基于SSR 分子标记的辽西地区驴群体遗传多样性分析

武师良，王昱彤，党婉怡，韩 迪，王占红，张晓鹰，杨秋凤，豆兴堂，张立斌，张树义，尚嵩洋*，邹丽娜，赵艳娇，张庆治，方 坤

(1.辽宁省现代农业生产基地建设工程中心，辽宁沈阳 110032；2.沈阳农业大学动物科学与医学学院，辽宁沈阳 110866；3.辽宁省农产品出口服务中心，辽宁大连 116000；4.建平县动物疫病预防控制中心，辽宁朝阳 122400）

驴(Equus asinus），属奇蹄目、马科、马属，形似马，多为灰褐色、头大、耳长、胸部稍窄、四肢瘦弱、躯干长于四肢，呈小长方型；颈项部皮薄肉厚，蹄小坚实；体质健壮，抵抗能力很强。中国驯养驴最早记录出现在距今约4000 年的铜器时代，随后进行杂交，因数量稀少，被定为稀有物种[1-2]。早期养驴主要目的为使役，随着现代化社会的发展和农业机械化的普及，自20世纪80 年代起驴的役用价值逐渐减退。驴皮、驴肉等本具有较高产业价值，但近年来会受到市场及行业发展水平的影响，商业水平较低，导致我国驴的存栏量呈下降趋势，一些品种面临灭绝风险[3-5]。

辽宁西部的朝阳市建平县、阜新市阜新蒙古族自治县(以下简称阜蒙县）等地区具有较长的养驴历史，是我国主要驴养殖地区，养殖的驴俗称“辽西驴”，品种多为眼周、嘴部和腹部白色被毛且其余部分为黑褐色被毛的三粉驴，少数为眼周、嘴部和腹部白色被毛且其余部分为棕灰色被毛体型较小的灰驴[6]。“辽西驴” 在当地经过多年的繁殖具备一定品种特征，经过科学选育有望发展成为地方改良品种。目前，我国正在开展第三次畜禽遗传资源普查工作。辽西地区虽有多年的养驴历史，但却未对其养殖群体的遗传多样性进行过评估。微卫星标记又称SSR 分子标记(Simple Sequence Repeat，SSR），是以2～6bp 碱基重复为特征的DNA 序列，广泛存在于基因组非编码区[7]，具有分布广泛、特异性强、保守性、高度多态性，高效性等特点，常用于分析不同物种的遗传多样性[8,9]。因此，本研究应用13 个SSR分子标记对三个辽西驴群体进行遗传多样性分析，以期为辽西驴进一步选育和其种质资源开发提供助力。

1 材料与方法

1.1 试验材料

实验样本采自建平县和阜蒙县，样本采集时间为2021 年11 月—2022 年3 月，其中建平县两个地点分别采集三粉驴50 头和灰驴17 头，共两个群体；阜蒙采集三粉驴32 头(表1）。实验使用EDTA 抗凝负压采血管采集颈静脉血2mL 或采集含毛囊的颈部鬃毛保存于95%乙醇的离心管中，低温带回实验室用于后续试验。

1.2 试剂与仪器

血液/细胞/组织基因组DNA 提取试剂盒购自天根生化科技有限公司 (北京）提取DNA；Easy Taq MasterMix 扩增酶购自北京全式金生物。仪器：超微量分光光度计(Thermo Fisher Scientific，NanoDrop 2000）、PCR 扩 增仪 (Applied Biosystems，ProFlex PCR systems）、电泳仪 (北京六一生物科技有限公司，DYY-7C）、凝胶成像仪 (北京赛智创业科技有限公司，ChampGel 5000plus）

1.3 试验方法

1.3.1 基因组DNA 提取

取200 μL 血液或从鬃毛样品中取下约20 颗毛囊，根据试剂盒说明书提取基因组DNA，使用1%琼脂糖凝胶电泳检验DNA 条带是否清晰，同时使用超微量分光光度计检测样品DNA 的OD值及浓度。将合格样品分装于-20℃冰箱保存，用于后续实验。

1.3.2 PCR 扩增

本试验以3 个群体99 头驴的基因组DNA 为模板，选取国际动物遗传学会(International Social of Animal Genetic，ISAG）推荐的13 个SSR分子标 记：AHT4，ASB23，HSM2，HMS3，HMS6，HMS7，HMS18，HTG7，HTG10，TKY297，TKY312，TK337，TKY343，通过本试验室构建的多重PCR 扩增体系获得3 个辽西驴群体在各个位点上的分型结果[10,11]。

PCR 反应体系如下：PCR 反应体系15 μL，包括1 μL DNA 模板(20～100ng/μL），7.5 μL 2×EasyTaq MasterMix 扩增酶，按最佳剂量添加各位点引物，剩余部分用双蒸水补足。PCR 程序：95℃预变性3min；95 ℃变性30s，58.5℃退火30s，72℃延伸40s，30 个循环；最后72℃延伸5min。

1.3.3 毛细管电泳

PCR 扩增产物置于4℃，避光保存，送至生工生物工程(上海）有限公司进行毛细管电泳检测。样品采用3730xl DNA 分析仪进行毛细管电泳检测，使用GeneMapper V4.0 软件分析各个微卫星标记的分型结果。

1.3.4 数据分析

等位基因数(Number of alleles，Na）、有效等位基因数(Effective number of allele，Ne）、观测杂合度 (Observed heterozygosity，Ho）、期望杂合度(Expected heterozygosity，He）、多态信息含 量 (Polymorphism information content，PIC）使用Genepop V4.2 软件分析；哈迪温伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium，HWE）使用Cervus V3.0.7 软件分析；使用PopGene V3.2 软件计算这4 个群体间Nei's 的遗传距离，并通过Mega V 7.0.26 软件利用遗传距离数据建立NJ 聚类树。

2 结果

2.1 SSR 分子标记多态性分析

在3 个辽西驴群体的99 个个体中共检测到93 个等位基因，13 个SSR 分子标记的等位基因数(Na）范围是4～11 个，平均为7.1538 个；等位基因数最多的位点是AHT4 (11 个），最少的位点是HMS6，HMS7 和TKY343 (4 个）；观测杂合度 (Ho）和期望杂合度 (He）分别为0.2020～0.8384 和0.2210～0.8121，其中位 点AHT4 的Ho 和He 最高分别为0.8384 和0.8121；多态信息含量(PIC）为0.2080～0.7810，平均值为0.6036，其中高多态性位点 (PIC≥0.50）有10 个，分别为AHT4、ASB23、HMS2、HMS3、HMS18、HTG7、HTG10、TKY297、TKY312、TKY343；中度多态性位点 (0.25≤PIC＜0.50）有2 个分别为HMS6 和TKY337；低多态性位点(PIC＜0.25）有一个为HMS7 (见表2）。13 个位点中只有位点HMS7 偏离哈迪温伯格平衡(＜0.05）。

表2 13 个微卫星位点遗传多样性参数

2.2 群体遗传多样性分析

由表3 可知，3 个群体的平均等位基因数为5.3077～6.6920，平均值为5.9230，建平灰驴平均等位基因数最低(5.3077），建平三粉驴平均等位基因数最高(6.6920）；观测杂合度平均值为0.6331，建平三粉驴最高(0.6585），建平灰驴最低(0.6063）；3 个群体的期望杂合度平均值为0.6474，建平三粉驴最高(0.6508），阜蒙三粉驴最低(0.6424）；多态信息含量平均值为0.5917，建平三粉驴最高(0.6026），建平灰驴群体最低

表3 3 个群体的遗传多样性水平

(0.5849）。

2.3 遗传距离

由表4 可知，3 个群体的遗传距离和遗传相似度分别为0.0254～0.0457 和0.9554～0.9749，两个三粉驴群体的遗传距离最小(0.0254）遗传相似度最高(0.9749）；阜蒙三粉驴和建平灰驴的遗传距离最大 (0.0457），遗传相似度最低(0.9554）。根据Nei's 遗传距离构建3 个群体的NJ 聚类树。如图1 所示，3 个群体分为两支，建平灰驴独立为一支，建平三粉驴群体与阜蒙三粉驴聚为一支。

图1 根据Nei's 遗传距离构建的NJ 聚类树

表4 3 个群体的Nei's 遗传距离（对角线以下）与遗传相似度（对角线以上）

3 讨论

本研究使用国际动物遗传学会(ISAG）推荐的13 个SSR 分子标记利用多重PCR 技术对辽宁西部地区三个驴群体进行遗传多样性分析。在应用SSR 分子标记对德州驴、广灵驴、津南驴等不同品种进行的遗传多样性研究时，研究人员多使用每个标记单独扩增的方法进行检测，试验效率相对较低，成本较高[13-18]。而本研究采用了多重PCR 技术，可通过1 次PCR 反应获得13 个SSR分子标记的分型结果，相比于每个位点单独扩增的方法显著提高了试验效率[11]。

Botstein 等[19]提出用PIC 来衡量位点的多态性，PIC 值越高位点的多态性越高。辽西地区3个群体13 个位点的多态信息含量为0.2080～0.7810，平均值为0.6036，范围与Zeng 等[18]应用25 个SSR 分子标记对我国多个驴品种进行遗传多样性分析的研究结果相近(PIC 值为0.1489～0.8670）。本研究13 个SSR 标记的PIC 平均值结果略高于刘艳艳等[13]所研究的两个德州驴群体(PIC 平均值0.47），这可能与检测的群体以及SSR 分子标记的选择不同有关。本研究使用的13个SSR 分子标记中有10 个SSR 标记属于高度多态性(PIC≥0.50），2 个SSR 标记属于中度多态性(0.25≤PIC＜0.50），1 个SSR 标记HMS7 属于低多态性(PIC<0.25），高度多态性位点占比92.31%，因此这些位点可以用于驴群体遗传多样性分析。

遗传杂合度又称基因多样度，是用于评估群体遗传多样性的重要指标，其值越高表明种群的遗传多样性、遗传变异、稳定程度越高[20]。一个群体的杂合度大于0.5，说明该群体遗传多样性丰富[21]。本研究所选择的13 个SSR 分子标记中，11 个位点 杂合度大于0.5 (AHT4，ASB23，HSM2，HMS3，HMS18，HTG7，HTG10，TKY297，TKY312，TK337，TKY343），说明这些位点可以提供较大的信息，利于辽西地区3 个驴群体的遗传多样性分析。本研究中辽西地区3个群体的期望杂合度为0.6424～0.6508，期望杂合度最高为建平三粉驴，最低为阜蒙三粉驴。Di等[17]2017 年收集5 个中国本土驴群体，He 为0.68～0.73；Zeng 等[18]2020 年收集20 个中国本土驴群体，He 为0.6315～0.6999 均与本研究结果相似，说明辽西地区三个驴种群平均杂合度较高。

分析辽宁西部地区3 个群体(建平三粉驴、阜蒙三粉驴、建平灰驴）间的遗传距离可以发现，建平三粉驴与阜蒙三粉驴间的遗传距离最小(0.0254）遗传相似度最高(0.9749），表明建平三粉驴与阜蒙三粉驴间的遗传分化很小；建平灰驴与建平三粉驴和阜蒙三粉驴的遗传距离分别为0.0409 和0.0457，遗传相似度分别为0.9600 和0.9554，说明建平灰驴与另两个群体间存在一定的遗传分化。

4 结论

本研究使用国际动物遗传学会推荐的13 个用于驴的SSR 分子标记对3 个辽西地区驴群体进行遗传多样性分析，结果表明3 个群体具有很高的遗传多样性及遗传杂合度，建平灰驴与建平三粉驴和阜蒙三粉驴存在一定程度的遗传分化。本研究的结果可为辽宁西部地区驴遗传育种和种质资源保护及开发提供理论依据。