免疫荧光染色法在基层医院诊断肺结核中的应用价值分析

练亿香，罗海军，蒋莎莉

（长沙市中心医院病理科，湖南 长沙 410004）

目前结核病仍然是单一传染性病原体导致死亡的最常见原因，全球有30 个相关高负担国家，中国是其中之一[1]。肺结核是由结核分枝杆菌侵入肺部引起的慢性呼吸系统传染病，常累及多个脏器甚至引起死亡，已经成为全球性公共卫生问题[2]。然而，多年来面临的相关诊断难题一直未能彻底解决（即如何早期、快速、准确地诊断结核病）。肺组织活检诊断肺结核的病理形态学具有一定的局限性，相当程度受病理医师的基本知识、阅片经验及逻辑思维的影响，带有主观性和经验性，且有些疾病的组织形态学具有共同性或者相似性，在常规染色下因“同形”而难以区别，特异性低，单从组织形态学上难以确诊。因此目前在基层医院，病理科诊断肺结核主要是根据病理形态学改变结合传统抗酸染色法检测结核杆菌进行确诊[3]。抗酸染色方法简单、成本低，但是灵敏度低，易漏诊[4]。TB-DNA-RNA 具有高灵敏度和特异度，是诊断肺结核的可靠手段，但该技术对实验室环境、设备、操作人员都有较高的要求，且临床收费高，很多基层医院因条件受限无法开展。因此，基层医院病理科亟需一种敏感度、特异性高且经济实惠的技术辅助诊断肺结核。本研究主要是评估免疫荧光染色法诊断肺结核的性能，探索能替代TB-DNA 检测的诊断策略。

1 对象与方法

1.1 研究对象

从2022 年1 月至2022 年12 月在长沙市中心医院病理科经肺组织活检考虑肺结核的病例中选取已做TB-DNA 检测项目，并且具有咳嗽、咳痰、发热等临床症状病例的组织标本453 例。其中排除影像学结果缺失的45 例，抗酸染色结果缺失的21 例，最终387例病例的组织进行免疫荧光染色法检查。本研究符合《赫尔辛基宣言》的原则，经长沙市中心医院医学伦理委会批准，伦理编号：2023-002。

1.2 检测方法

1.2.1 抗酸染色法 所选肺组织行石蜡切片，采用脱蜡液进行脱蜡至水，滴加石炭酸复红染色15 min，水洗，盐酸酒精脱色至无色，亚甲基蓝复染，蒸馏水清洗，常规脱水、晾干、封片。由两位医师用光学显微镜阅片判读。

1.2.2 免疫荧光染色法 所选肺组织行石蜡切片，脱蜡至水，滴加免疫显色试剂Ⅲ（湖南华厚科技有限公司生产）A 液染色15 min，水洗，滴试剂B 液脱色，直到肉眼观察无色为止，水洗。由两位医师在荧光显微镜下观察判读。

1.2.3 TB-DNA-PCR 石蜡切片后脱蜡，使用核酸提取/ 纯化试剂盒提取核酸。配置PCR 反应液（TB PCR 反应液12.5μl+TB 引物探针混合液3.5μl+H2O 4μl），加入5μl 样本核酸。在荧光定量PCR 仪上进行45 个循环扩增及信号采集。反应结束后根据荧光曲线调整基线和阈值，得到各样本CT 值。若曲线呈圆滑S 型，质控合格，CT 值≤37, 可判为阳性。

1.3 统计学处理

用SPSS 27.0 软件分析数据。连续指标用中位数记录；分类指标用频数和百分比记录。两种方法“和”联合代表双阳性判读为阳性，两种方法“或”联合代表双阴性判读为阴性。一致性用kappa 值评估。绘制受试者工作曲线（ROC），计算曲线下面积（AUC）及其95% 置信区间。计算敏感度、特异度、阳性预测值（PPV）、阴性预测值(NPV)、风险比值比（OR）及置信区间，并进行比较[5]。统计学意义的临界值取双侧α=0.05。

2 结果

2.1 一般资料

共纳入387 例进行分析，TB-DNA 阳性例数为234 例（60.5%），抗酸染色为阳性的占31.0%（120例），免疫荧光为阳性的占50.9%（197 例）。在TBDNA 阳性组中，病理形态学异常率达97.4%，抗酸染色法的阳性率为49.6%。在TB-DNA 阴性组中，抗酸染色法和免疫荧光染色法阳性率分别为2.6%和3.9%，而影像学检查考虑结核的比例为61.4%，见图1。

图1 不同方法在TB-DNA 阳性或阴性组中的阳性率

2.2 不同检查方法与TB-DNA 检测结果的一致性

肺结核诊断的一致性分析见表1。TB-DNA 法与免疫荧光法的kappa 值为0.746（95%CI=0.681-0.811），与 抗 酸 染 色 法 的kappa 值 为0.416（95%CI=0.343-0.489）。

表1 不同检查方法与TB-DNA 检测结果的一致性

2.3 不同方法诊断肺结核的性能

以TB-DNA 为 参 照，影 像 学 检 查 的AUC 为0.580（0.532-0.627），病 理 形 态 学 的AUC 为0.788（95%CI=0.748-0.828），抗酸染色法的AUC 为0.735（95%CI=0.700-0.769），免疫荧光染色法的AUC 为0.889（95%CI=0.859-0.918），见图2。

图2 不同检查诊断肺结核的ROC 曲线

不同检查方法的诊断性能见表2。病理形态学的敏感度为97.4%（95%CI=94.5%-99.1%），特异度为60.1%（95%CI=51.9%-67.9%）。抗酸染色法的敏感度和特异度分别为49.6%（95%CI=43.0%-56.2%）、97.4%（95%CI=93.4%-99.3%），免 疫 荧 光 染 色 法的敏感度和特异度分别为81.6%（95%CI=76.1%-86.4%）、96.1%（95%CI=91.7%-98.5%）。免 疫 荧光染色法与抗酸染色法的特异度差异无统计学意义（P=0.500），敏感度具有统计学意义上的差异（P＜0.001）。

表2 不同检查方法诊断肺结核的性能

2.4 不同方法联合诊断肺结核的性能

在所有受试者中，病理形态学和免疫荧光染色法的敏感度和特异度分别为79.9%（95%CI=74.2%-84.9%）和96.7%（95%CI=92.5%-98.9%）。病理形态学或免疫荧光染色法的敏感度和特异度分别为99.1%（95%CI=96.9%-99.9%）和59.5%（95%CI=51.3%-67.3%）。见表3。

表3 不同方法联合诊断肺结核的性能

3 讨论

肺结核在我国呈高发态势，发病率居世界前列。在临床上，此病患者可出现午后低热、盗汗、咳嗽、咯血等症状, 通常以行胸部X 线、痰找结核杆菌的常规方法检测。但是有些患者的临床症状不典型, 常规方法阳性率不高，需要病理组织的确诊。传统抗酸染色法与改良的抗酸染色法在肺泡灌洗液或痰液标本检测中的敏感度为33.3%～63.8%[6-8]。TB-DNA 在痰液、肺泡灌洗液检测的研究中，敏感度均＞90%[7,9-10]。如果缺少TB-DNA 检测，许多基层医院患者很容易漏诊，延误治疗，造成结核病病情不断进展，甚至危及生命。本研究中免疫荧光染色法与TB-DNA 的kappa 值为0.746，相比于抗酸染色法、病理形态学，一致性最高。抗酸染色法的PPV 为96.7%，但敏感度低。免疫荧光染色法的AUC 为0.899，具有很好的鉴定力，敏感度、特异度、PPV、NPV 分别为81.6%、96.1%、97.0%、77.4%，准确性指标均衡。其NPV（77.4%）偏低，但高于抗酸染色法（55.4%）。病理形态学的敏感度高（97.4%），但特异度仅为60.1%。病理形态学和免疫荧光染色法的联合检查结果双阳性判读为阳性，任一结果为阴性判读为阴性时，其敏感度低（79.9%），特异度和阳性预测值高（均＞95%）。病理形态学或免疫荧光染色法的联合，双阴性判读为阴性，任一结果为阳性判读为阳性时，其敏感度高（99.1%），阴性预测值高（97.8%），表明这种联合对肺结核的漏诊率低，并且双阴性者患肺结核的概率很低。

综合而言，免疫荧光染色法操作简单，相比TBDNA 收费低，临床准确性指标都优于抗酸染色法，与TB-DNA 检测的一致性高。病理形态学或免疫荧光染色法对TB-DNA 阳性标本检出率达99%，NPV 在95%以上，在缺乏开展TB-DNA 检测能力的基层医院，其是一种潜在的替代诊断策略，该策略的实际临床价值还需多中心前瞻性的临床研究来验证。