地肤子总黄酮脱色工艺及抗氧化活性研究

徐蕊，袁永雷，曲丽萍,

1.上海贝泰妮生物科技有限公司（上海 200335）；2.云南贝泰妮生物科技集团有限公司（昆明 650106）；3.云南云科特色植物提取实验室有限公司（昆明 650106）

地肤子[Kochia scoparia（L.）Schrad.]为藜科、地肤属植物的干燥成熟果实，又名地葵、地麦、竹帚子、孔雀松。地肤子在山东、江苏、河南、河北、云南等地区有广泛分布，其常生于山野、荒地、路旁，亦有庭院栽培用于观赏。地肤子是一种具有悠久用药历史的传统中药材，始载于《神农本草经》，列为上品。对其描述“性味辛、苦，性寒，具有清热利湿、祛风止痒、利尿通淋的功效”[1]，现代临床中常用于治疗瘙痒、湿疹等皮肤类疾病[2]。《滇南本草》记载，地肤子可利膀胱小便积热，洗皮肤之风，疗妇人诸经客热[3]。《本草纲目》记载：“地肤嫩苗，可作蔬茹”，地肤子在民间也被叫作扫帚菜，其嫩叶可作为蔬食之物，营养美味，老株可为扫帚，打扫庭院。

研究表明，地肤子具有抗炎[4]、抗过敏[5]、抗病原菌[6]、抗氧化[7]等作用，其主要化学成分包括三萜皂苷类化合物、黄酮类化合物、挥发油和微量元素等[1,8-10]。地肤子皂苷Ic（Momordin Ic）作为主要有效成分，具有抗炎、抗瘙痒和抗过敏的作用[11-12]。地肤子提取物中富含黄酮类化合物，是其发挥抗氧化活性的物质基础，能够清除体内过量自由基，对于其发挥抗氧化和抗衰能力具有重要意义[7,10,13]。

目前对于地肤子中活性成分的提取主要采用水提[14]、醇提[15-17]等传统工艺，但是多糖、蛋白质等其他杂质也会随之溶出，增加了分离纯化工艺的难度，且黄酮部位颜色较深，多为棕褐色，会极大影响地肤子提取物的色泽、纯度，限制其在药品、功效性护肤品和保健食品等领域的应用。

常用的除色素的方法有活性炭、大孔树脂、膜脱色、过氧化氢脱色等[18-19]。活性炭脱色法的原理是利用孔状结构对色素产生吸附作用，使有效成分与色素分离，达到脱色目的[20]。活性炭作为常用吸附剂，在工业化生产中得到广泛应用，具有吸附能力强、无异味等特点。

因此，试验先通过大孔树脂富集地肤子的黄酮部位，选用活性炭作为试验脱色剂，以活性炭添加量、脱色温度和脱色时间为考察因素，设计正交试验，筛选最佳的地肤子黄酮提取液脱色技术工艺。试验致力于解决地肤子脱色问题，提升地肤子提取物在药品、保健食品和功效性护肤品领域的应用，为地肤子提取物投入生产实践提供理论依据，具有重要的理论意义和实用价值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

地肤子药材（云南省昆明市）；活性炭粉767针用活性炭（上海活性炭厂）；AB-8大孔吸附树脂（沧州宝恩吸附材料科技有限公司）；无水乙醇、氢氧化钠、硝酸铝和亚硝酸钠（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；DPPH（1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼，2, 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，≥98%）、维生素C（≥99%）、芦丁（≥98.7%）：上海源叶科技有限公司。

1.2 仪器与设备

XPE105电子分析天平（瑞士梅特勒）；R-100旋转蒸发仪[步琦实验室设备贸易（上海）有限公司]；DF-101S电热恒温水浴锅（上海景宁科学仪器有限公司）；MULTISKAN SkyHigh酶标仪（赛默飞世尔科技公司）；GM-0.33A蠕动泵（上海蚁霖科学仪器有限公司）；Agilent 1260 InfinityⅡ高效液相色谱仪（安捷伦科技美国有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 地肤子黄酮提取液制备

地肤子黄酮提取液制备参考文献方法[7, 11]并进行适当调整。称取100 g地肤子药材，选择体积分数70%的乙醇为提取溶剂，料液比1∶10（g/mL），采用回流提取装置进行加热回流提取，减压浓缩得到地肤子浸膏。用200 g AB-8大孔树脂进行分离纯化，依次用纯水洗脱2 BV（树脂柱体积）和体积分数为40%的乙醇洗脱5 BV，去除杂质和非目标成分，使用体积分数为80%的乙醇洗脱8 BV，收集80%乙醇洗脱液，减压浓缩得到棕褐色地肤子黄酮提取液。

1.3.2 芦丁标准曲线制作

参照文献[21-22]的亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠比色法，配制质量浓度为1 mg/mL芦丁标准溶液，倍半稀释，置于10 mL的容量瓶中，加入0.4 mL 5%亚硝酸钠溶液，放置反应6 min，然后加入0.4 mL 10%硝酸铝溶液，放置反应6 min，再加入0.4 mL 5%的氢氧化钠溶液后放置反应15 min，定容。在500 nm波长下测定吸光度。以芦丁溶液浓度（x）和吸光度（y）做标准曲线，用Origin软件绘制芦丁标准曲线。得到线性回归方程：y=0.510 9x+0.012 7，R2=0.997 1。

1.3.3 脱色效果评价指标

采用地肤子提取液的黄酮保留率和脱色率两个指标作为对地肤子黄酮提取液活性炭脱色效果的评价。采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠比色法在500 nm下测定提取脱色前后提取液吸光度，黄酮保留率按式（1）进行计算。

根据文献方法[23]，测定地肤子提取液脱色前后提取液在420 nm处测量的吸光度，脱色率按式（2）进行计算。

采用综合加权评分法[24-25]进行考察，黄酮保留率和脱色率两项考察指标权重系数均为0.5，综合评分按式（3）进行计算。

1.3.4 单因素试验

选取三种因素（活性炭添加量、脱色温度和脱色时间）作为地肤子提取液脱色工艺的考察因素，分别进行单因素试验，考察以上三个因素对脱色效果的影响。

取100 g地肤子黄酮提取液于烧杯中，溶液呈深棕褐色，按照试验设计，加入一定量的活性炭，在一定温度下水浴加热搅拌一段时间，趁热过滤除去活性炭，收集地肤子黄酮提取液脱色后的滤液，备用。

1.3.4.1 活性炭添加量对脱色效果的影响

分别取100 g地肤子黄酮提取液，置于200 mL烧杯，考察活性炭添加量0.3%，0.5%，1%，1.5%和2%对脱色率和黄酮保留率的影响。设置反应温度50 ℃、反应时间30 min，过滤去除活性炭，过滤后比较各滤液颜色。离心取上清液，按1.3.3小节中所述方法对地肤子黄酮提取液的黄酮保留率和脱色率进行计算。

1.3.4.2 脱色温度对脱色效果的影响

分别取100 g地肤子黄酮提取液，置于200 mL烧杯，按照1%活性炭加入量，考察脱色温度30，40，50，60和70 ℃对脱色率和黄酮保留率的影响。反应30 min后过滤去除活性炭，比较不同温度条件下的滤液颜色。离心后取上清液，按1.3.3小节中所述方法对地肤子黄酮提取液的黄酮保留率和脱色率进行计算。

1.3.4.3 脱色时间对脱色效果的影响

分别取100 g地肤子黄酮提取液，置于200 mL烧杯，按1%的活性炭添加，在50 ℃水浴加热，考察脱色时间10，20，30，40和50 min对脱色率和黄酮保留率的影响。过滤去除活性炭，比较不同脱色时间条件下的滤液颜色。按1.3.3小节中所述方法对地肤子黄酮提取液的黄酮保留率和脱色率进行计算。

1.3.5 正交试验设计

根据地肤子黄酮提取液脱色单因素的试验结果，活性炭添加量、脱色温度和脱色时间三种因素是影响地肤子黄酮提取液脱色效果的主要因素。因此选取活性炭添加量、脱色温度和脱色时间三因素进行地肤子黄酮提取液脱色的正交试验设计，每个因素选取3个水平，并对试验结果进行统计分析，以确定最佳的工艺参数。正交试验中各因素的水平设计见表1。

表1 因素水平

1.3.6 抗氧化试验

参考文献[26-27]，采用1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基法（DPPH）评价地肤子提取物的抗氧化能力。配制0.1 mg/mL DPPH溶液和0.5 mg/mL维生素C溶液，备用。维生素C溶液备用，倍半稀释，得到6个以上不同浓度的溶液，作为阳性对照。配制质量浓度为0.5 mg/mL地肤子溶液。加入DPPH溶液，振荡摇匀，室温避光反应30 min，在波长517 nm处测定吸光度。DPPH自由基清除率按式（4）进行计算。

式中：AS为样品组测定吸光度；ASB为样品空白组测定吸光度；AC为控制组测定吸光度；ACB为控制空白组测定吸光度。

1.3.7 数据处理

采用SPSS数据分析软件进行变化显著性分析。使用Origin软件对数据进行统计分析并绘制图表，所有试验重复3次，*表示P＜0.05显著性差异。

酒堡背倚山峦，在城堡墙头仰望，一片平缓的山坡开阔地延绵到高处密不透风的山林。庄主打开一本蓝图，描述了规划中楚樽阁景象。山坡上将建成空中酒阁，与酒堡互为犄角，由藏酒而品酒。以酒宴为主题，构思礼仪、服饰、音乐、舞蹈，尽显先秦年代楚国风格的酒文化文章。届时，登临楚樽阁沐浴更衣，焚香执礼。品一樽美酒时，佐酒的是古琴楚乐，《楚辞·九歌》。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果与分析

2.1.1 活性炭添加量对脱色效果的影响

考察不同活性炭添加量对地肤子黄酮部位提取液的黄酮保留率和脱色率影响，结果如图1所示。

观察滤液颜色发现，地肤子黄酮滤液颜色随着活性炭添加量的增加由深至浅。由图1可以看出，在试验设置的范围内，脱色率随活性炭添加量增加而上升，但提取液的黄酮保留率却随活性炭添加量增加而降低，该现象与金华等[21]在优化银杏叶脱色工艺中测定活性炭用量对脱色效果的影响时类似。因此为了保证地肤子黄酮提取液的脱色率和黄酮保留率均处在较高水平，综合实际情况考虑后，确定使用1%活性炭添加量作为后续试验最佳添加量。

2.1.2 脱色温度对脱色效果的影响

考察不同脱色温度对地肤子黄酮部位提取液的黄酮保留率和脱色率影响，结果如图2所示。

图2 脱色温度对地肤子黄酮提取液脱色效果的影响

观察滤液颜色发现，地肤子黄酮提取液的滤液颜色随着温度的增加而逐渐变浅。由图2可以看出，在试验设置的温度范围内，地肤子黄酮提取液的脱色率随温度的升高先增加后下降，50 ℃达到最高，脱色率75.25%，总体趋势较为平缓；黄酮保留率呈现先上升后下降的趋势，趋势明显，在温度为60 ℃时黄酮保留率达到最高65.09%。温度升高会加速色素分子扩散，有利于脱色，但同时会导致黄酮保留率降低，故脱色温度70 ℃时黄酮保留率下降原因可能是过高的温度降低活性炭对黄酮的吸附作用。当温度升至50 ℃时，黄酮保留率较高，同时脱色率也处于较高水平，因此选择50 ℃作为后续试验的脱色温度。

2.1.3 脱色时间对脱色效果的影响

考察不同脱色时间对地肤子黄酮部位提取液的黄酮保留率和脱色率影响，结果如图3所示。

图3 脱色时间对地肤子黄酮提取液脱色效果的影响

2.2 正交试验结果与分析

根据单因素试验分析，选取活性炭添加量、脱色温度和脱色时间三个因素进行地肤子黄酮提取液脱色的正交试验设计。选择黄酮保留率和脱色率的综合评分来确定最佳工艺条件。按照1.3.3小节公式计算综合评分。

综合评分=（脱色率/85.26）×100%×50%+（黄酮保留率/79.52）×100%×50%，试验结果见表2。

表2 正交试验设计与结果

由表2和表3可知，按照对地肤子黄酮提取液脱色效果影响程度，影响顺序为A＞B＞C，即活性炭用量（A）对脱色效果影响最为显著（P＜0.05），是脱色工艺流程的关键条件，其次为脱色温度（B）和脱色时间（C）。因此，根据正交试验结果确定地肤子黄酮提取液脱色的最佳工艺A1B3C1，即活性炭添加量0.5%，脱色温度60 ℃、脱色时间20 min时效果最好。

表3 方差分析表

2.3 最佳工艺验证试验

为了检验地肤子黄酮提取液的正交试验所得结果的可靠性，在最佳试验条件下进行验证试验。平行取3份制备的地肤子黄酮提取液，试验脱色温度为60 ℃，加入0.5%活性炭，脱色时间20 min，计算地肤子黄酮提取液的黄酮保留率和脱色率。同时，使用HPLC对地肤子提取液中的活性成分地肤子皂苷Ic的含量进行测定[28]。结果见表4。

表4 工艺验证试验（n=3） 单位：%

在此条件下，3次试验脱色率均值为64.07%，黄酮保留率均值为77.58%，符合预期结果。表明正交试验所优化的最佳工艺稳定可行。试验采用活性炭脱色法能够除去提取物中杂质、色素和可能存在的致敏成分，脱色后的滤液呈浅黄色，地肤子提取液的色泽得到了显著改善。此工艺脱色效果好且有效成分含量波动范围较小，可以极大地拓展地肤子提取物的应用。

2.4 抗氧化活性

地肤子提取物具有优异的抗氧化活性[7,11]。如图4所示，地肤子提取物脱色前和脱色后对DPPH自由基均有较好的清除效果，DPPH自由基清除率随着浓度的增加而逐渐加强，且脱色前的地肤子提取物清除率优于脱色后清除率。

图4 地肤子提取物对DPPH自由基的清除能力

经计算，VC的IC50值为0.013 3 mg/mL，脱色前的地肤子提取物半抑制浓度IC50为0.063 1 mg/mL，脱色后的地肤子提取物半抑制浓度IC50为0.114 5 mg/mL，脱色前地肤子提取物对DPPH自由基清除能力高于脱色后。其原因可能是脱色工艺使得地肤子提取物中的一部分总黄酮损失，影响了总黄酮的抗氧化活性。经脱色工艺处理后地肤子提取物在明显改善色泽的同时依然具有较好的抗氧化活性。

3 结论

试验采用单因素考察和正交试验对地肤子黄酮部位活性炭的脱色工艺进行设计和优化，确定地肤子黄酮提取液的脱色最佳工艺：活性炭添加量0.5%，脱色温度60 ℃，脱色时间20 min。在此条件下进行验证试验：地肤子黄酮提取液脱色率均值可达64.07%，地肤子黄酮提取液的黄酮保留率均值可达77.58%。经脱色工艺处理后的地肤子黄酮提取液颜色由棕褐色变为澄清的浅黄色，该脱色工艺既保证了地肤子黄酮提取液具有较好的脱色效果，又保证了其黄酮保留率处于较高水平，且此脱色工艺对地肤子提取物中的活性成分地肤子皂苷Ic的损失较小。

另外，研究通过脱色前后的地肤子提取物对DPPH自由基清除作用评价抗氧化活性。结果表明脱色前的地肤子提取物抗氧化活性优于脱色后，其原因可能是脱色工艺使得地肤子提取物中的一部分总黄酮损失，影响了总黄酮的抗氧化活性。经此脱色工艺优化后的地肤子提取物在改善色泽的同时具有良好的抗氧化活性。后续将进一步探究地肤子提取物作为天然活性成分的应用。

因此，优选脱色工艺后所得到的地肤子黄酮部位外观得到显著改善，解决了地肤子在实际应用中颜色深的问题，降低风险刺激以及增加产品附加值，具有更好的应用价值，为地肤子提取物的工业化生产提供了数据支持和参考。