基于SCoT标记的胡椒属药用植物多样性分析

零唯　杨丹　谭勇　黄鼎　林敬祯　明如宏

摘要 采用正交设计优化胡椒属药用植物SCoT-PCR反应体系，并运用SCoT分子标记对7种胡椒属药用植物31份样品进行遗传多样性研究。结果表明，胡椒属药用植物SCoT-PCR最佳反应体系：总体积20 μL，其中10×Buffer 2.0 μL，dNTPs 0.20 mmol/L，Mg2+ 1.5 mmol/L，引物0.4 μmol/L，模板DNA 100 ng，Taq聚合酶2.5 U。扩增总条带数为68条，其中多态性条带为64条，多态性比率为94.12%。31份胡椒属药用植物个体间聚类分析结果显示，31份胡椒属样品划分为2个类群，6个亚群。SCoT可适用于胡椒属药用植物遗传多样性研究。

关键词胡椒属；SCoT；正交优化；遗传多样性

中图分类号Q949.732.3文献标识码A

文章编号0517-6611（2023）08-0182-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.08.042开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Diversity Analysis of Piper Medicinal Plants Based on SCoT Markers

LING Wei YANG Dan TAN Yong et al（1.Institute of Pharmacy，Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning，Guangxi 530000;2.Guangxi Key Laboratory of Zhuang and Yao Ethnic Medicine，Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning，Guangxi 530200）

AbstractThe SCoT-PCR reaction system of medicinal plants of Piper was optimized by orthogonal design，and the genetic diversity of 31 samples of 7 species of medicinal plants of Piper was studied by SCoT molecular markers.The results showed that the best SCoT-PCR reaction system of Piper was as follows： the total volume was 20 μL，of which 10 × buffer 2.0 μL，dNTPs 0.20 mmol/L，Mg2+ 1.5 mmol/L，primer 0.4 μmmol/L，template DNA 100 ng，Taq polymerase 2.5 U.The total number of amplified bands was 68，of which 64 were polymorphic，with a polymorphism rate of 94.12%.The clustering results showed that 31 samples of Piper were divided into 2 groups and 6 subgroups.SCoT can be used to study the genetic diversity of medicinal plants of Piper.

Key wordsPiper;SCoT;Orthogonal optimization;Genetic diversity

胡椒屬（Piper）为胡椒科（Piperaceae）最大的属之一，在全球约有2 000 多种，主要分布在热带和亚热带地区［1］，我国有60多种，其中30多种入药，主要产地为云南、广东、广西、海南等省区［2］。胡椒属药用植物具有重要的药用价值，在民间多用作止痛、活血和抗风湿性疾病药物［3］，现代研究表明其具有抗菌、抗抑郁、抗血栓等药理作用［4-6］。除药用外，胡椒属药用植物还作为调味品用于食品烹饪以及芳香性精油用于香水工业中［7-8］。由于胡椒属药用植物野生种类分布范围狭小、资源稀少［9］，为有效保护和利用胡椒属药用植物资源，有必要对胡椒属药用植物遗传多样性进行研究。

起始密码子多态性（start condon targeted polymorphism，SCoT）是Collard等［10］根据植物基因组ATG翻译起始位点侧翼序列的保守性而开发的一种目的基因分子标记，其具有操作简单、引物通用性强、遗传信息丰富、多态性好等优点，目前已成功应用于栀子［11］、地黄［12］、秦艽［13］等药用植物的遗传多样性研究。因此，该试验运用SCoT标记技术对31份胡椒属药用植物样品进行遗传多样性分析，挖掘胡椒属药用植物遗传信息，为胡椒属药用植物的种质选育和资源保护提供理论参考依据。

1材料与方法

1.1试验材料该试验采集31份胡椒属药用植物新鲜嫩叶为供试材料，采集样品经广西中医药大学药用植物教研室戴忠华副教授鉴定，其中29份材料采自广西各地，2份材料采自海南，样品信息见表1。

1.2试验方法

1.2.1DNA提取及质量测定。参照天根多糖多酚提取植物基因组DNA试剂盒提取步骤对胡椒属药用植物DNA进行提取，将符合要求的DNA溶液稀释至50 ng/μL，放于-20 ℃冰箱保存。

1.2.2单因素考察。参照尚小红等［14］的研究，设定SCoT-PCR初始扩增反应体系：总体积20 μL，10×Buffer 2.0 μL，dNTPs 0.25 mmol/L，Mg 1.5 mmol/L，引物 0.8 μmol/L，模板DNA 50 ng，Taq聚合酶1 U，剩余部分用ddHO补齐，其中DNA模板为假蒌J10，引物为SCoT 21；扩增程序：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30个循环，最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。对SCoT反应体系中的dNTPs浓度、Mg浓度、引物浓度、模板DNA用量以及Taq聚合酶量进行单因素考察，每个因素设置6个梯度水平，见表2。

1.2.3正交优化试验。根据单因素试验结果，设计L16（45）正交表优化SCoT-PCR反应体系，每处理2次重复（表3）。正交试验的反应体系以及反应程序与单因素试验相同。

1.2.4引物筛选以及退火温度的优化。采用优化后的反应体系对61条SCoT引物进行筛选，引物选用 Collard等［10］开发设计SCoT的引物。选用PCR仪的退火温度梯度模式，设置温度区间为引物TM值±5 ℃，对引物进行退火温度优化。

1.2.5SCoT-PCR扩增与数据处理。利用筛选出的引物对31份胡椒属药用植物进行扩增。对扩增结果进行条带统计，建立0/1矩阵。利用POPGENE 3.2软件进行分析获得遗传相似系数，采用NTSYS 2.10软件对胡椒属7个品种31份样品进行聚类分析。

2结果与分析

2.1单因素试验

2.1.1dNTPs浓度对SCoT-PCR扩增效果的影响。如图1所示，6条泳道均能扩增出条带。dNTPs浓度在0.15～0.30 mmol/L，条带清晰可辨，亮度适中；当浓度在0.35～0.40 mmol/L，条带出现弥散现象，清晰度下降。因此选定0.15～0.30 mmol/L 为正交优化试验梯度水平。

2.1.2Mg浓度对SCoT-PCR扩增效果的影响。从图2可以看出，Mg浓度在1.5～2.5 mmol/L时，条带较为清晰，分离度较好；当Mg浓度为3.5 mmol/L时，虽扩增条带数量多、亮度适中，但与1.5、2.0 mmol/L相比，无明显优势。为了节约成本，因此选择1.5～3.0 mmol/L为正交优化试验梯度水平。

2.1.3引物浓度对SCoT-PCR扩增效果的影响。从图3可以看出，当引物浓度在0.3～0.6 μmol/L时，随着浓度的增加，扩增条带亮度、清晰度随之增强；当浓度超过0.7 μmol/L时，部分条带出现黏连情况，无法区分。因此选用0.3～0.6 μmol/L为正交优化试验梯度水平。

2.1.4模板DNA用量对SCoT-PCR扩增效果的影响。从图4可以看出，模板DNA用量为25和150 ng时，条带弥散、模糊；用量为50～125 ng，扩增谱带相似，谱带清晰且数量较多。综合考虑，选择50～125 ng为正交优化试验梯度水平。

2.1.5Taq聚合酶用量对SCoT-PCR扩增效果的影响。从图5可以看出，当Taq聚合酶用量为0.5和3.0 U时，部分条带存在模糊现象；当用量为1.0～2.5 U时，扩增条带较为清晰，条带带型差异性较小。因此选择1.0～2.5 U为正交优化试验梯度水平。

2.2SCoT正交试验正交电泳结果（图6）表明在16个组合2次重复中，所有的组合均能扩增出条带，大小在250～2 000 bp。从图6可以看出，16个组合对扩增结果的影响存在一定的差异。组合1和14都存在只扩增出2条条带的情况；组合2、3、7、8、9、11、12、13、14、15、16条带模糊；组合5、6扩增结果较好，条带清晰，分离度、亮度适中。其中组合5的2次扩增结果较为稳定，因此选择组合5为SCoT-PCR最佳反应组合，SCoT-PCR最佳反应体系为10×Buffer 2.0 μL、dNTPs 0.20 mmol/L、Mg 1.5 mmol/L、引物0.4 μmol/L、模板DNA 100 ng、Taq聚合酶2.5 U，用无菌水补足20 μL。

2.3引物筛选以及最佳退火温度的确定依据正交优化得到的最佳反应体系，对61条SCoT引物进行筛选试验。对各引物扩增结果进行评价，其中有9条引物能够扩增出清晰且多态性较好的条带，引物信息及其最佳退火温度见表4。

2.4SCoT扩增结果及多态性分析对31份胡椒属药用植物总DNA进行扩增，部分扩增图如图7所示。扩增结果如表5所示，9条引物扩增出68条条带；引物SCoT 24、SCoT 45、SCoT 49扩增条带数量最多，SCoT 61和SCoT 63最少；多态性条带为64条，多态性比率为94.12%。

2.5遺传相似性分析及聚类分析利用NTSYS 2.10软件算出31份胡椒属药用植物的遗传相似系数在0.37～0.91。其中亲缘关系最近的2份植物分别为采自广西中医药大学仙葫校区的假蒌J1与广西民族大学相思湖校区的假蒌J2，遗传相似系数为0.91；而亲缘关系最远的2份植物分别为广西南宁市宾阳县思陇镇水村的风藤F2和广西桂平市蒙圩镇新阳村龙潭山的假蒌J12，遗传相似系数为0.37。

聚类分析结果（图8）显示，当遗传相似系数0.54为阈值时，可将31份胡椒属植物分为2个大类，其中假蒌、荜茇、大叶蒟、苎叶蒟、胡椒聚为一类，荜茇、风藤、山蒟聚为一类；遗传相似系数为0.63时，大叶蒟单独聚为一类；胡椒和苎叶蒟在遗传相似系数为0.68时，可分为2个亚类。

3讨论与结论

SCoT标记是Collard等［10］开发的一种新型基因分子标记技术，具有操作简单、重复性好、遗传信息丰富、多态性好等优点，可以作为其他分子标记技术的有效补充［15］。SCoT分子标记技术已经应用于许多药用植物种属的遗传多样性分析中。程虎印等［16］采用 SCoT 分子标记技术对陕西产重楼属 6 个类群 48 份样品进行遗传多样性分析，结果显示重楼属植物在物种水平上具有较高的遗传多样性。马利奋等［17］采用SCoT分子标记对 17 个枸杞品种进行遗传多样性分析，聚类分析结果显示可将17个枸杞品种分为3个群类。陈大霞等［18］采用 SCoT 分子标记分析 4 种黄连属药用植物的遗传多样性，揭示出黄连属药用植物具有丰富的遗传多样性，种间存在高度的遗传分化。

SCoT聚类分析显示山蒟和风藤为一类，说明这2个品种遗传差异性小、亲缘关系接近。这与蔡诚诚等［19］基于ITS序列分析的研究结果相似，该研究发现风藤与山蒟的同源性高达97.65%，在形态和化学成分组成上也具有较高的相似度。由于在进行植物的遗传多样性分析时，所用材料的品种数量、样品数量和采集区域等因素均会对试验结果产生影响。该试验仅研究了31份胡椒属药用植物，在后续工作中应当进一步丰富材料来源和数量，从多个层面深入挖掘广西胡椒属药用植物的遗传信息，为胡椒属药用植物种质资源保护与品种选育提供参考。

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