北柴胡标准汤剂中柴胡皂苷量值传递规律研究

杜微波，张志强，陈敬然，万莹莹，沈建梅

（北京康仁堂药业有限公司，中药配方颗粒关键技术国家地方联合工程研究中心，北京市中药配方颗粒工程技术研究中心，北京 101301）

柴胡为伞形科植物柴胡Bupleurum chinense DC.或狭叶柴胡Bupleurum scorzonerifolium Willd. 的干燥根，按性状分别习称“北柴胡”和“南柴胡”，其中北柴胡为临床常用药。北柴胡中主要药效成分为柴胡皂苷（SS），具有抗菌、解热、镇静、抗炎、抗肿瘤、免疫调节等作用［1］。 SS 包含柴胡皂苷a（SSa）、柴胡皂苷c（SSc）、柴胡皂苷d（SSd）、柴胡皂苷f（SSf）等原生苷，柴胡皂苷b1（SSb1）、柴胡皂苷b2（SSb2）等次生苷。 近年来，学者采用高效液相色谱-紫外检测（HPLC-UV）法测 定SSa［2］或SSa+SSd［3-5］或SSa+SSc+SSd［6-9］或SSa+SSb2+SSc+SSd［10］或SSa+SSb2+SSc+SSd+SSf［11］、高效液相色谱-蒸发光散射检测（HPLC-ELSD）测定SSa［12］或SSa+SSd［13-14］或SSa+SSc+SSd+SSf［15］、液 相色谱-质谱联用技术（HPLC-MS）测定SSa+SSd［16］等，为北柴胡的质量评价提供了一定的参考信息。

中药标准汤剂是饮片以中医药理论为指导，临床应用为基础，经标准化工艺制备而成的水煎液。 在工艺过程中要关注各个成分是否存在转化、降解等现象，当成分的量传递较低，说明该成分在中药标准汤剂中转移较差或者发生分解（即负转化），若为主要活性成分，在生产中则需要进行控制，保证其临床药效，当成分的量传递明显过高时，说明该成分在中药标准汤剂中得到富集或由其他物质转化而来（即正转化），则应重点监控，控制富集或正转化程度，保证其临床应用的安全性。 因此，对成分的量值传递规律研究是中药标准汤剂的关键步骤，其决定了以中药标准汤剂为参照而制定的中药配方颗粒工艺的稳定性及所得产品的安全有效性。

《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》（《技术要求》）也明确了对量值传递的要求，“以出膏率、含量及含量转移率、指纹图谱或特征图谱、浸出物等的值为表征，详细说明生产全过程的量值传递情况”［17］。目前对于如何利用指纹图谱或特征图谱进行量值传递还处于摸索阶段，虽然现有研究尝试以相似度、峰相对保留时间及峰数目等方式描述标准汤剂化学成分的变化，但均属于定性评价，不适用于物质传递规律的分析［18-20］。

本研究以北柴胡为例，基于目前对北柴胡化学成分的研究情况，针对SS 进行特征图谱研究，采用双波长对北柴胡标准汤剂中的原生苷和次生苷进行监测。 并参照含量转移率，建立了以标准汤剂、饮片中单位浓度下特征峰峰面积、标准汤剂出膏率为因子的公式，计算K 值，在不需要测定各特征峰含量的前提下描述标准汤剂中SS 的量值传递，明确北柴胡标准汤剂的传递规律，用于指导北柴胡配方颗粒及含北柴胡经典名方制剂的生产研究及质量标准制定。

1 材料

表1 北柴胡材料来源

2 方法

2.1 北柴胡标准汤剂制备及出膏率测定

将北柴胡药材按2020 年版《中国药典》柴胡饮片炮制的规定进行炮制，获得北柴胡饮片。 取饮片适量于砂锅中，浸泡30 min，一煎加入饮片量9 倍水，武火（500 W）煮沸后，文火（200 W）煎煮20 min，趁热过滤，迅速冷却，备用；二煎加饮片量6 倍水，武火煮沸后，文火煎煮15 min，趁热过滤，迅速冷却备用，合并二次煎煮滤液，在50 ℃以下浓缩，浓缩至料液比约为1∶1，冷冻干燥，即获得北柴胡标准汤剂。称定北柴胡标准汤剂质量，计算出膏率。

2.2 特征图谱方法

2.2.1 对照品溶液的制备

取SSa、SSb1、SSb2、SSc、SSd、SSf 对照品适量，精密称定，加甲醇制成1 mL 含SSa、SSb1、SSb2、SSc、SSd、SSf 75 μg 的溶液，摇匀，即得。

2.2.2 供试品溶液制备

取标准汤剂及饮片粉末（过三号筛）适量，取约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入含5%浓氨试液的50%乙醇25 mL，密塞，称重，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，放冷，再称重，用5%浓氨试液的50%乙醇补足减失的粉量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 色谱条件及系统适用性试验

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长为10 cm，柱内径为2.1 mm，粒径为1.7 μm；以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按表2 中的规定进行梯度洗脱；检测波长为211 nm、250 nm；柱温35 ℃；流速0.4 mL/min；进样体积各3 μL。理论板数按SSa 峰计算，应不低于10 000。

表2 北柴胡标准汤剂流动相梯度洗脱程序

2.2.4 特征峰确认

测定18 批北柴胡标准汤剂、饮片特征图谱，使用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012.1 版本）［21］，按中位数计算，进行共有峰标识，生成对照图谱，并利用SSa、SSb1、SSb2、SSc、SSd、SSf 对照品溶液进行特征峰确定。

2.2.5 方法学考察

2.2.5.1 重复性试验

按2.2.2 项下方法制备供试品溶液6 份，记录其特征图谱，以SSa 为参照峰，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积。

2.2.5.2 中间精密度试验

采用不同仪器（岛津超高效液相色谱仪LC-30AD），按2.2.2 项下方法获得6 份供试品溶液的特征图谱，SSa 为参照峰，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积。

2.2.5.3 稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液，分别于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h 进样测定，记录色谱图，并以SSa 为参照物峰，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积。

2.3 饮片至标准汤剂量值传递分析

按2.2.2 项“供试品制备方法”制备18 批标准汤剂、饮片供试品溶液，按2.2.3 项色谱条件测定其特征图谱，以获得的特征图谱数据，计算K 值，分析饮片至标准汤剂物质传递情况。

3 结果

3.1 特征峰确认

采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012.1 版本），按中位数计算，对18 批北柴胡标准汤剂进行共有峰标识，生成的对照图谱见图1。

图1 18 批北柴胡标准汤剂对照图谱

通 过 对 比SSa、SSb1、SSb2、SSc、SSd、SSf 对 照 品溶液，分析确定了211 nm 下峰1 为SSc，峰2 为SSf，峰3 为SSa，峰4 为SSb2；250 nm 下峰6 为SSa，峰7为SSb2，峰9 为SSb1。 见图2。

图2 北柴胡标准汤剂特征图谱特征峰确认

3.2 特征图谱方法学

3.2.1 重复性试验

各特征峰相对保留时间的相对标准偏差（RSD）为0.11%～0.26%，相对峰面积的RSD 为1.07%～2.68%，表明该方法重复性良好。

3.2.2 中间精密度试验

各特征峰的相对保留时间的RSD 为0.1%～0.2%，相对峰面积的RSD 为0.3%～1.6%。 不同仪器间相对保留时间RSD 范围为0.1%～0.5%，相对峰面积RSD 范围为1.5%～21.8%，结果表明该特征图谱的在不同仪器间相对保留时间符合分析要求，不同仪器间相对峰面积差异较大。

3.2.3 稳定性试验

各特征峰的相对保留时间RSD 为0.1%～4.0%，相对峰面积的RSD 为1.0%～4.1%，表明供试品溶液在24 h 内测定结果稳定。

3.3 饮片至标准汤剂物质传递分析

以18 批北柴胡饮片及标准汤剂特征峰峰面积、样品浓度及出膏率计算K 值，结果见表3。

表3 18 批北柴胡中柴胡皂苷的K 值

由表3 可知，18 批北柴胡饮片与北柴胡标准汤剂的各峰量值传递的K 值趋势一致，但传递的效率不一。其中峰1、2、3、4、8 的K 值小于1，表明该类成分至标准汤剂中不易转移或发生分解（即负转化），峰7、9 的K 值大于1，表明该类成分至标准汤剂中得到富集或存在物质的正转化过程，而峰5、峰6 在不同批次中传递趋势不同。

4 讨论

北柴胡主要化学成分为皂苷、黄酮、挥发油、甾醇、香豆素、多糖类、木脂素等，具有解热、抗炎、抗病毒、抗细菌内毒素、抗肿瘤、保肝、降血脂、抗惊厥、提高免疫力等作用，其中生理活性较强有皂苷、黄酮、挥发油等［22］。 北柴胡标准汤剂是中药饮片的水煎液，因此物质基础主要为水溶性成分。 梳理活性成分发现，黄酮类成分多为水溶性，但该类成分主要分布于地上部分［23］，根中含量较低；挥发油成分由于其挥发性，汤剂中不易获得。 SS 为柴胡主要活性成分，且水溶性较好，为本研究的目标分析物质。 由于SS 结构的不稳定性，在酸性及高温等条件下，原生苷易降解为次生苷。 因此，针对标准汤剂中原生苷与次生苷成分，利用UPLC 建立了真实反映标准汤剂物质成分的特征图谱方法。

指标成分转移率是以成分含量的相对值进行定量评价，能够表明物质成分的变化趋势，但仅适用于有对照品参照的成分。 本研究参照指标成分转移率公式，以特征峰峰面积、样品浓度、出膏率为因子，建立基于特征图谱分析物质传递规律的K 值。 K 值是以峰面积进行比对，不需引入成分对照品进行含量测定，在缺少成分对照品的前提下也能够进行分析，同时降低了多因子对于结果分析的影响，能够科学分析标准汤剂量值传递规律。

由表3 可知，饮片至标准汤剂过程中主要物质都进行了传递，但传递效率不一。 峰1、2、3 分别为211 nm 下的SSc、SSf、SSa，由于转化为次生皂苷，因此较小，多在0.10 左右。峰6 为250 nm 下的SSa，而SSa 末端紫外吸收，因此在250 nm 上灵敏度较差，导致传递趋势不一；同样峰4 为211 nm 下的次生皂苷SSb2，在211 nm 上灵敏度较差，SSb2的传递规律以250 nm 峰7 为 参 照。 峰7、9 为 次 生 苷SSb2和SSb1，K 值均大于1，这与原生苷SSa、SSd 在标准汤剂中不同程度的转化有关。 根据文献报道SSa 转化为SSb1，SSd 转化为SSb2，对比SSb1与SSb2的K 值可知，SSb2K 值大于SSb1，说明SSd 转化程度较大，这与李军等［24］对水煎液中SSa、SSd 的溶出与转化差异研究结果一致。 综上，北柴胡标准汤剂物质传递规律符合SS 成分特性，表明K 值能够准确分析标准汤剂制备过程中物质的变化规律。 根据《技术要求》中药配方颗粒应以标准汤剂为参照物的要求，应根据北柴胡标准汤剂制备过程中物质的变化规律及各化学成分对北柴胡功效的影响，对北柴胡配方颗粒的质量控制指标进行转变，应由传统的SSa+SSd转变为SSa 或SSa+SSb2，同时在配方颗粒生产过程中，也应着重对各工艺环节影响上述指标的因素进行研究，控制SSa 负转化及SSb2正转化的程度，确保成分的量与标准汤剂相当，保证配方颗粒与标准汤剂的一致性。

本研究利用北柴胡标准汤剂专属性UPLC 特征图谱方法，结合K 值，明确饮片至标准汤剂中各化学成分的传递情况，可根据《技术要求》明确可接受范围，用于指导以标准汤剂为参照的北柴胡配方颗粒生产全过程，保证临床用药的安全性、有效性，为其他药材标准汤剂量值传递规律的分析提供参考。