基于PI3K/Akt 信号通路探讨重楼皂苷Ⅶ对人结直肠癌细胞增殖的影响

2023-05-22侯亚妮孙中华刘志勇褚志杰白克运

山东中医药大学学报 2023年3期

侯亚妮，孙中华，刘志勇，褚志杰，白克运

（山东中医药大学，山东济南 250355； 2.山东中医药大学附属医院，山东济南 250014）

结直肠癌（CRC）是世界范围内癌症相关死亡的主要原因之一，是最常见的消化道恶性肿瘤，85%以上CRC 由息肉发展为腺瘤再转为腺癌，其发病率和病死率呈逐年上升的趋势［1-3］。由于前期发病症状不明显，CRC 发现时多已进入中晚期，临床中多采用手术切除，辅以放疗、化疗，但是治疗周期长，不良反应明显，且术后复发率高，严重影响患者生活质量。

近年来中药在癌症治疗中发挥了重要作用。通过查询2020 年《中国药典》得知，重楼的重要组成成分为重楼皂苷（PP），包含重楼皂苷Ⅰ（PPⅠ）、重楼皂苷Ⅱ（PPⅡ）以及重楼皂苷Ⅶ（PPⅦ）。 PP 有抑制肿瘤细胞增殖和转移、促进细胞凋亡和自噬、抑制新生血管形成、逆转肿瘤多药耐药和调节机体免疫功能等作用［4］。与经典的细胞毒性药物相比，现代抗癌药物更倾向于针对癌症中作用突出的各种信号通路。磷脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信号通路在肿瘤发生、发展方面起到重要作用，与癌细胞增殖和凋亡、周期调控、血管形成、侵袭、转移密切相关［5］。网络药理学分析表明，PI3K/Akt 信号通路是PP 抗CRC 的核心通路，具有重要研究价值［6］。然而，关于PPⅦ是否能够通过调控PI3K/Akt 信号通路抑制CRC 发生发展，尚未见报道。本研究旨在阐明PPⅦ对CRC 细胞增殖的抑制作用和潜在分子机制，为PP 类药物的研发提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

人结直肠癌细胞HT29 由山东中医药大学附属医院迟莉丽课题组惠赠，人结直肠癌细胞LoVo 购自中国科学院上海生命科学院细胞资源中心，PPⅠ（A0386）、PPⅡ（A0387）、PPⅦ（A0390）购自成都曼斯特生物科技有限公司。RPIM-1640 培养基（CM10040）、Ham’s F-12K 培养基（CM10025）、胰蛋白酶（CC017-500）、青霉素-链霉素（CC004）、磷酸盐缓冲液（PBS）（CC008）均购自中科迈晨科技有限公司，胎牛血清（04-001-1ACS）购自Biological Industries，BeyoClickTM EdU 细胞增殖检测试剂盒（C0088S）、SDS-PAG 凝胶配置试剂盒（P0012A）均购自碧云天生物技术有限公司，BCA 浓度检测试剂盒购自大连美仑生物技术有限公司，抗体蛋白激酶B（Akt，＃4685）、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt，＃4060）、磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K，＃4257）、磷酸化磷脂酰肌醇3 激酶（p-PI3K，＃4228）均购自赛信通生物试剂有限公司，甘油醛3 磷酸脱氢酶（GAPDH）（60004-1-Ig）购自武汉三鹰生物技术有限公司，山羊抗鼠（ZB-2305）、山羊抗兔（ZB-2301）均购自北京中杉金桥科技生物有限公司，增强型化学发光液（WBKLS0500）购自默克密理博实验室设备有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

在培养基中添加10%胎牛血清（FBS）和1%双抗，配置成完全培养基，HT29 细胞株常规培养于RPMI-1640 培养基中，LoVo 细胞株常规培养于Ham’s F-12K培养基中，细胞置于37 ℃、含5% CO2的细胞培养箱中培养，细胞生长融合至细胞培养皿面积的80%～90%，按照1∶3（HT29）和1∶2（LoVo）的比例胰酶消化传代。取对数生长期的细胞用于后续实验。

1.2.2 重楼皂苷配置

取1 mg 药物溶解到1 mL DMSO 中，获得终质量浓度为1 mg/mL 的药物母液，存于-20 ℃长期避光保存。取10 μL 药物母液用每种细胞所需培养基定容至1 mL，获得终质量浓度为100 μg/mL 的药物母液，短期4 ℃避光保存，用前以培养基稀释。

1.2.3 四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测细胞活力

取对数生长期的HT29 和LoVo 细胞，PBS 冲洗两遍，胰酶消化离心后，加入完全培养基制备成细胞悬液计数。将细胞接种于96 孔板，调整每孔细胞浓度为8×103个细胞，定容至100 μL，培养过夜后细胞生长融合至细胞培养孔板面积的50%，并加入梯度浓度的PPⅠ、PPⅡ、PPⅦ和顺铂，每种药物设置1 个主孔与4 个复孔，处理48 h，随后每孔加入0.5%的MTT 溶液20 μL，继续培养4 h。加入DMSO 150 μL，放入酶标仪检测490 nm 处吸光度。分析并计算药物的最大半抑制浓度值（IC50值）。

1.2.4 克隆形成实验

取对数生长期的HT29 和LoVo 细胞，PBS 冲洗两遍，胰酶消化离心后，加入完全培养基制备成细胞悬液计数。将细胞以500 个/孔接种到6 孔板，培养24 h 后，设空白组（0 μg/mL）及PPⅦ给药组，给药组加入梯度浓度的PPⅦ（0.375 μg/mL、0.750 μg/mL），置于37 ℃，5% CO2的培养箱中继续培养，每3 d 更换含药的完全培养基1 次，10 d 后终止培养，4%甲醇固定30 min，0.5%结晶紫染色20 min，PBS 冲洗两遍，拍照并计数。克隆抑制率（%）=［（空白组克隆形成率- 给药组克隆形成率）/空白组克隆形成率］×100%。

1.2.5 EdU 细胞增殖检测（TMB 法）

取对数生长期的HT29 和LoVo 细胞制备成细胞悬液并计数。将细胞接种于96 孔板，调整细胞浓度为8×103个细胞每孔，定容至100 μL，培养过夜后细胞密度达50%，并加入梯度浓度的PPⅦ（0 μg/mL、3 μg/mL、6 μg/mL）干预48 h 后终止培养，每孔加入2×EdU 工作液100 μL，37 ℃孵育2 h，去除培养基，加入4%甲醇固定15 min，PBS 冲洗3 次，每次5 min，加入100 μL 通透液，孵育15 min，PBS 冲洗2 次，每次5 min，加入内源性过氧化物酶100 μL，孵育20 min，PBS 冲洗3 次，每次2 min，制备Click 反应液，每孔加入50 μL，避光孵育30 min，PBS 冲洗3 次，每次5 min，制备Streptavidin-HRP 工作液，每孔加入20 μL，孵育30 min，PBS 冲洗3 次，每次2 min，加入100 μL TMB 显色液，孵育30 min，放入酶标仪检测450 nm处吸光度（OD）。细胞增殖率（%）=（对照组OD 值-实验组OD 值）/对照组OD 值。

1.2.6 蛋白质印迹法（Western blotting）检测蛋白表达

取对数生长期的HT29 和LoVo 细胞制备成细胞悬液并计数。将细胞以8×106个/孔接种于6 孔板，培养24 h 后，加入梯度浓度的PPⅦ（0 μg/mL、3 μg/mL、6 μg/mL）干预48 h 后终止培养，将细胞刮下收集到EP 管中，离心去上清液，仅保留细胞团，按照裂解液∶蛋白酶抑制剂PMSF∶磷酸酶抑制剂=100∶1∶1的比例混匀，配置到EP 管中，冰上裂解30 min。 4 ℃条件下，13 200 r/min 离心15 min，离心半径为6 cm，取上清液，BCA 法检测蛋白浓度，根据结果使用PBS调整蛋白浓度，95 ℃加热5 min 使蛋白变性。每个泳道上样30 μg 蛋白，80 V 恒压条件下10% SDS-PAGE胶分离蛋白后，260 mA 转膜（PVDF 膜）2 h，用含5%脱脂奶粉的TBST 溶液封闭1 h（磷酸化指标用5%BSA 封闭1 h）。分别孵育PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt 抗体（1∶1000），4 ℃条件下孵育过夜。 TBST 洗膜3 次，每次10 min。室温孵育二抗1 h，TBST 洗膜3 次，每次10 min，ECL 发光液显影。

1.3 统计方法

结果采用Graph Pad Prism 8.0 统计软件进行统计分析，数据均以x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间比较采用LSD-t 检验。取α=0.05为检验水准。

2 实验结果

2.1 重楼皂苷对HT29 和LoVo 细胞活力的影响

重楼皂苷对细胞活力的影响，用MTT 法进行检测。采用梯度浓度的重楼皂苷和顺铂（阳性对照）分别干预HT29 细胞和LoVo 细胞48 h，MTT 法检测细胞活力。结果表明，PPⅦ能有效降低HT29 和LoVo 细胞的活力。见图1。通过对IC50值分析发现，PPⅦ干预HT29 细胞的IC50值为（6.94±0.52）μg/mL，干预LoVo 细胞的IC50值为（5.75±0.31）μg/mL。低于顺铂干预的HT29 细胞（12.18±1.33）μg/mL 和LoVo 细胞（11.80±1.66）μg/mL，而PPⅠ和PPⅡ对应数值均高于顺铂，见表1。据此，后续实验选用PPⅦ进行。

图1 重楼皂苷（PP）Ⅰ、PPⅡ、PPⅦ、顺铂对人结直肠癌细胞HT29 和LoVo 活力的影响

表1 重楼皂苷与顺铂对应的IC50 值比较

2.2 PPⅦ抑制HT29 和LoVo 细胞的克隆形成能力

由于克隆实验细胞种植数量较少，设定质量浓度3 μg/mL、6 μg/mL 均无法产生细胞团，故依次减少药物质量浓度直至0.75 μg/mL 可形成细胞团。结果显示，与0 μg/mL 组比较，0.75 μg/mL 组能显著抑制HT29 的克隆形成数目（P＜0.01）。对LoVo 细胞，0.375 μg/mL、0.750 μg/mL 剂量组的PPⅦ可显著抑制其克隆形成数目（P＜0.05）。说明随着PPⅦ质量浓度的增加，细胞克隆形成数目减少，对克隆形成的抑制率升高。见表2。

表2 不同质量浓度重楼皂苷Ⅶ对细胞克隆形成情况影响的比较（）

注：与0 μg/mL 组比较，＊P＜0.05；与0.375 μg/mL 组比较，＃P＜0.05。

组别克隆形成数/个克隆抑制率/%HT29 细胞 LoVo 细胞 HT29 细胞 LoVo 细胞0 μg/mL 组 152.00±16.39 74.00±3.27 - -0.375 μg/mL 组 120.67±16.98 57.00±2.45＊ 20.89±3.97＊ 22.97±0.09＊0.750 μg/mL 组 25.67±11.26＊＃ 27.33±2.05＊＃ 83.62±6.54＊＃ 62.95±3.63＊＃

2.3 PPⅦ抑制HT-29 和LoVo 细胞的增殖能力

使用BeyoClickTM EdU 细胞增殖检测试剂盒检测PPⅦ对细胞增殖情况的影响，PPⅦ干预HT29细胞的IC50值为（6.94±0.52）μg/mL，干预LoVo 细胞的IC50值为（5.75±0.31）μg/mL，故选择梯度浓度PPⅦ（0 μg/mL、3 μg/mL、6 μg/mL）干预细胞48 h后，检测450 nm 处吸光度。发现与0 μg/mL 组比较，PPⅦ质量浓度为3 μg/mL、6 μg/mL 组增殖率均降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。与3 μg/mL 组比较，6 μg/mL 组HT29 细胞增殖率降低不明显，差异无统计学意义（P＞0.05），LoVo 细胞增殖率降低明显，差异有统计学意义（P＜0.05）。结果说明随着PPⅦ质量浓度增加至IC50值，细胞增殖能力显著减弱。见表3。

表3 不同质量浓度重楼皂苷Ⅶ对细胞增殖影响比较（）

注：与0 μg/mL 组比较，＊P＜0.05；与3 μg/mL 组比较，＃P＜0.05。

组别增殖率/%HT29 细胞 LoVo 细胞0 μg/mL 组 - -3 μg/mL 组 -0.35±0.11＊ -0.33±0.10＊6 μg/mL 组 -0.44±0.09＊ -0.60±0.07＊＃

2.4 PPⅦ对HT-29 和LoVo 细胞中PI3K/Akt 信号通路的影响

用梯度浓度的PPⅦ（0 μg/mL、3 μg/mL、6 μg/mL）处理HT29 和LoVo 细胞48 h，PPⅦ可以下调PI3K、Akt 的磷酸化水平。见表4、表5、图2。

图2 重楼皂苷Ⅶ处理人结直肠癌细胞HT-29 和LoVo 细胞48 h 后PI3K/Akt 信号通路中的蛋白表达

表4 重楼皂苷Ⅶ对HT29 细胞PI3K/Akt 通路相关蛋白表达的影响（）

注：GAPDH 为甘油醛3 磷酸脱氢酶，Akt 为蛋白激酶B，p-Akt 为磷酸化蛋白激酶B，PI3K 为磷脂酰肌醇3 激酶，p-PI3K 为磷酸化磷脂酰肌醇3 激酶。与0 μg/mL 组比较，＊P＜0.05，与3 μg/mL 组比较，＃P＜0.05。

组别 Akt/GAPDH p-Akt/GAPDH p-Akt/Akt PI3K/GAPDH p-PI3K/GAPDH p-PI3K/PI3K 0 μg/mL 组 0.97±0.10 1.02±0.14 1.05±0.07 1.04±0.13 1.20±0.13 1.16±0.05 3 μg/mL 组 0.92±0.04 0.70±0.09＊ 0.76±0.06＊ 0.99±0.12 0.80±0.08＊ 0.81±0.02＊6 μg/mL 组 1.03±0.13 0.34±0.06＊＃ 0.34±0.08＊＃ 1.06±0.15 0.51±0.13＊ 0.49±0.14＊＃

表5 重楼皂苷Ⅶ对LoVo 细胞PI3K/Akt 通路相关蛋白表达的影响（）

注：GAPDH 为甘油醛3 磷酸脱氢酶，Akt 为蛋白激酶B，p-Akt 为磷酸化蛋白激酶B，PI3K 为磷脂酰肌醇3 激酶，p-PI3K 为磷酸化磷脂酰肌醇3 激酶。与0 μg/mL 组比较，＊P＜0.05；与3 μg/mL 组比较，＃P＜0.05。

组别 Akt/GAPDH p-Akt/GAPDH p-Akt/Akt PI3K/GAPDH p-PI3K/GAPDH p-PI3K/PI3K 0 μg/mL 组 1.04±0.02 0.99±0.02 0.96±0.02 0.98±0.00 1.06±0.03 1.08±0.03 3 μg/mL 组 1.01±0.04 0.99±0.02 0.98±0.01 0.76±0.04＊ 0.83±0.03＊ 1.08±0.02 6 μg/mL 组 1.06±0.04 0.25±0.01＊＃ 0.23±0.00＊＃ 1.01±0.04＃ 0.61±0.02＊＃ 0.61±0.01＊＃

3 讨论

CRC 是胃肠道中常见的恶性肿瘤，早期症状不明显，随着病情的进展患者逐渐出现便血、排便习惯改变、腹泻、腹泻与便秘交替、腹痛等表现，进展到晚期则会出现贫血、体质量减轻等全身症状。根据临床表现，可将CRC 归属于中医学积聚、肠澼、肠覃等病证范畴［7］。 CRC 的发生与先天禀赋不足、后天失养有关，慢性肠道疾病可损伤阳气，耗伤气阴，使阴阳失调，主要病机为湿热蕴结、气滞血瘀、正气亏虚等［8］。但是近年来随着癌毒理论的提出，对肠息肉病因的认识不断深入，魏小曼等［9］认为，脾气亏虚是大肠癌发生发展的内在基础，湿热瘀毒是大肠癌发生发展的重要条件，故治疗中抗癌解毒是关键点。

研究表明，中药及其提取物对肿瘤具有抑制作用，具体体现在抗增殖、促凋亡、抗转移、抗血管生成、调节自噬、逆转多药耐药等方面［10］。重楼具有清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊的功效，药理作用研究发现其具有抗肿瘤、抗病毒、抗炎、止血、镇痛、抑制精子活性、治疗淋巴结结核溃疡等作用［11］，重楼软坚汤辅助放化疗可以提高肺癌患者近远期疗效，2 年生存率显著提高［12］。近年来，国内外研究证明，在治疗恶性肿瘤方面，PP 及其提取物可以抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制细胞侵袭和迁移［13］。张特等［14］研究发现，PPⅠ可以通过直接靶向抑制表皮生长因子受体，以阻断其下游信号通路起到治疗乳腺癌的作用。张亮等［15］研究发现，PPA 与转录因子家族-1 相互结合可以阻断蛋白磷酸酶2A 癌性抑制因子/蛋白激酶B 信号通路，从而抑制胃癌细胞的增殖并诱导凋亡。何昊等［16］研究发现，PPⅦ能够抑制人胰腺癌PANC-1 细胞的增殖、迁移和侵袭，并且下调程序性死亡分子配体-1 蛋白表达，参与免疫调节，从而抑制胰腺癌的发展。

CRC 最主要的恶性生物学特征为淋巴转移和远端转移，而去分化、失去黏附约束以及运动性和侵袭性增强，都是肿瘤增加恶性质的标志［17］。研究发现，PI3K/Akt/mTOR 通路与CRC 的发病、转移、耐药和干细胞相关，该通路是药物治疗的首选靶点［18］。PI3K/Akt 信号通路激活是调节肿瘤细胞增殖和凋亡的经典信号通路之一，该通路与卵巢癌、膀胱癌及CRC 的发展密切相关［19-21］。He 等［22］研究报道，PPⅦ通过下调PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt 的表达阻断PI3K/Akt通路激活，进而抑制人肺癌A549 细胞增殖并诱导细胞凋亡。因此，通过抑制PI3K/Akt 信号通路的水平治疗癌症可能会成为未来治疗CRC 的发展方向。在本实验中，采用MTT 比色法验证了PPⅦ对CRC细胞增殖的抑制作用，结果表明CRC 细胞HT29 和LoVo 经PPⅦ干预48 h 后，药物浓度越高，肿瘤细胞的活力越差，细胞克隆实验、细胞增殖实验表明，随着药物浓度的增加，细胞的增殖能力逐渐降低，说明PPⅦ可随着剂量增大有效抑制CRC 细胞的恶性生物学行为。

PI3K/Akt 信号通路由磷酸化磷脂酰肌醇3-羟基的脂类激酶活性PI3K 及下游Akt 组成，PI3K 是由p110 和p85 亚基组成的异源二聚体，可被各种生长因子受体和癌基因启动，通过磷酸化Akt 的Ser473和Thr308 位点从而将其激活［23］。因此，抑制PI3K/AKT 信号通路是多种药物对抗CRC 作用的机制。研究证实，从紫草中分离的脱氧紫草素可以通过下调PI3K/Akt/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路抑制CRC 的发展，莲房原花青素可能是通过抑制Ras相关C3 肉毒菌毒物底物1（RAC1）/PI3K/AkT 信号通路实现抑制肿瘤恶性生物学行为的作用，紫花前胡素可能通过抑制PI3K/Akt 信号通路的激活影响CRC 细胞的增殖、凋亡及迁移［24-25］。在本研究中我们发现PPⅦ下调人结直肠癌细胞HT29 和LoVo 中PI3K 和Akt 蛋白磷酸化表达水平，结果提示PPⅦ可能通过降低PI3K 和Akt 磷酸化水平抑制PI3K/Akt通路的激活，从而抑制HT29 和LoVo 细胞的增殖并诱导细胞凋亡。

综上所述，PPⅦ对CRC 细胞的增殖具有明显抑制作用，且随着药物浓度的提高抑制作用越发显著，其机制可能与通过下调PI3K、Akt 的磷酸化水平，抑制PI3K/Akt 信号通路有关。该研究为PPⅦ治疗CRC 提供实验依据和新的思路，并且为天然植物成分进行CRC 的治疗提供了一定的理论依据，下一步将对PPⅦ治疗CRC 的分子机制进行更加深入研究。