参芪复方对衰老糖尿病模型大鼠骨骼肌蛋白质合成代谢及mTOR 信号通路的影响

田 苑，钟 文，杨 燕

（1.成都医学院，四川 成都 610500； 2.成都中医药大学附属医院，四川 成都 610072）

衰老是肌少症最根本的因素，伴随年龄增加的不可避免的肌量损失和功能下降可导致原发性肌少症［1-2］。 糖尿病是引发继发性肌少症的重要病因，糖尿病能加速因葡萄糖毒性、胰岛素抵抗以及某些遗传因素导致的肌肉损失［3］。 骨骼肌作为重要的糖代谢器官，其肌量的丧失会导致严重的全身代谢紊 乱［4］。

肌少症可导致跌倒、骨折、功能下降、老年人失去独立性等，也能增加死亡率［5］。 衰老和糖尿病的各种病理因素导致骨骼肌肌量丢失、功能减退，使衰老糖尿病肌少症成为一种普遍的共病状态，对老年人生活质量和生命安全造成不可忽视的危害，带来巨大的医疗和经济负担。 最新的《中国老年糖尿病诊疗指南（2021 年版）》中也明确将“肌少症与衰弱”列为老年糖尿病共患疾病［6］。 骨骼肌是调节葡萄糖和蛋白质代谢的重要器官，保护骨骼肌肌量和功能，能够阻止老年衰弱状态和肌少症，遏制老年性代谢疾病的发生发展。

肌量减少是肌少症的核心诊断标准，骨骼肌蛋白质合成和分解代谢的平衡是肌量的保证。 本研究基于中医脾主肌肉理论，探讨中药参芪复方调控哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路，干预衰老糖尿病大鼠肌量减损的分子机制，以期为中医药防治糖尿病肌少症提供新的思路。

1 材料

1.1 实验动物

3 月龄健康无特定病原体（SPF 级）Wistar 雄性大鼠50 只，体质量200～250 g，成都达硕实验动物公司，许可证号为SCXK（川）2015-030，实验动物福利伦理审核申请备案编号为2019-25。 动物饲养区域通风、控温、控湿，温度22～23 ℃，湿度55%～56%。实验动物分笼饲养，3～5 只/笼。 饲养环境保持清洁干燥，定期消毒。 实验区黑暗与光照交替时间为每12 h 一次。

1.2 主要试剂与仪器

参芪复方组成：人参、黄芪、山药、生地黄、山萸肉、天花粉、丹参、制大黄，成人一日剂量：人参、黄芪均15 g，大黄6 g，余皆为10 g。 制备参芪复方浸膏，每毫升含1.44 g 生药，由成都中医药大学附属医院药剂科生产提供。 磷酸西格列汀片（西格列汀）：每片100 mg，默沙东公司，批号J20140095。 磷酸西格列汀混悬液：将西格列汀片研成细末，加蒸馏水30 mL 混匀制备混悬液。 D-半乳糖：SIGMA 公司，货号G0750-50G。 链脲佐菌素（STZ）：MAYA 公司，货号833208-14684-1G。 mTOR 通路磷酸化悬浮芯片：Full Moon 公司，芯片货号PMT138。 乙二胺四乙酸（EDTA）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司，货号E196386。 考马斯亮蓝G-250：北京索莱宝科技有限公司，货号C8420。 牛血清血蛋白BSA：Merck 公司，货号A1933-25G。 三氯乙酸（TCA）：上海麦克林生化科技有限公司，货号T834457。

数显恒温水浴锅：上海昕仪仪器仪表有限公司，型号XY-SYG-14。 冷冻离心机：Thermo Scientific 公司，型号Heraeus Pico & Fresco。 超速离心机：Thermo Scientific 公司，型号Sorvall WX 80+。 超声波清洗器：深圳市洁盟清洗设备有限公司，型号JP-720PLUS。高通量组织研磨器：宁波新芝生物科技有限公司，型号Sceintz-48。

2 方法

2.1 分组与造模

50 只Wistar 雄性大鼠适应性喂养1 周，8 只大鼠以生理盐水腹腔注射，为空白组；另10 只腹腔注射D-半乳糖（50 mg/kg，日1 次）42 d，为衰老模型组；另外32 只大鼠腹腔注射D-半乳糖42 d，并于第13 天喂养高脂高糖饲料，30 d 后腹腔一次性注射STZ（40 mg/kg），筛选空腹血糖（FPG）≥11.1 mmol/L 者为衰老糖尿病模型鼠。 空白组及衰老模型组以同等容量的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液腹腔注射作为对照。

衰老糖尿病模型大鼠按照血糖由高到低进行排列并编号，采用随机数字表法分为衰老糖尿病模型组、参芪复方组、西格列汀组。 分组后衰老糖尿病模型组和西格列汀组各11 只，参芪复方组10 只，加空白组8 只，衰老模型组10 只，共5 组。

2.2 干预

造模后进行药物干预，干预时长为8 周。 空白组、衰老模型组及衰老糖尿病模型组灌服生理盐水，参芪复方组和西格列汀组的给药剂量相当于成人剂量的10 倍，每周测量大鼠体质量，并根据体质量变化，及时调整灌胃药量。 各组具体给药方案见表1。

表1 各组大鼠给药方案

2.3 标本采集与处理

大鼠处死前12 h 禁食不禁水，腹腔注射2%戊巴比妥（45 mg/kg）麻醉，置于冰盘四肢固定。 将腓肠肌自起点（股骨内、外侧髁）至止点（跟骨结节处）完整取下。 在磷酸盐缓冲液（PBS）中洗净血迹洗3 次，用剪刀剪碎腓肠肌，然后置于离心管中加入5%预冷缓冲液至浸没，待测肌纤维与肌浆蛋白含量，在保证统计量有效的前提下，每组取3 只样本；余腓肠肌组织分装至微型离心管（EP 管）并标记，放置于液氮中，存放温度为-80 ℃，用于蛋白磷酸化抗体芯片检测。

3 统计学方法

统计分析软件为SPSS 22.0，计量资料以x±s 表示，各组数据分别进行正态性检验和方差齐性检验，符合正态分布且方差齐，采用单因素方差分析，组间比较采用LSD 法；不符合方差齐性要求则进行秩和检验。 取α=0.05 为检验水准。

4 结果

4.1 各组大鼠腓肠肌肌纤维蛋白质量浓度比较

各组大鼠腓肠肌肌纤维蛋白质量浓度比较，差异无统计学意义。 见表2。

表2 各组大鼠腓肠肌肌纤维蛋白质量浓度比较（）

表2 各组大鼠腓肠肌肌纤维蛋白质量浓度比较（）

组别 n 肌纤维蛋白质量浓度/（μg/mL）空白组 3 75.65±0.42衰老模型组 3 75.37±1.11衰老糖尿病模型组 3 74.27±1.74参芪复方组 3 74.50±0.79西格列汀组 3 75.20±0.95

4.2 各组大鼠腓肠肌肌浆蛋白质量浓度比较

结果显示，衰老糖尿病模型组大鼠骨骼肌肌浆蛋白质量浓度显著降低。 与衰老糖尿病模型组比较，参芪复方组和西格列汀组都能提高衰老糖尿病模型大鼠的腓肠肌肌浆蛋白质量浓度。 见表3。

表3 各组大鼠腓肠肌肌浆蛋白质量浓度比较（）

注：与衰老糖尿病模型组比较，＊P＜0.05。

组别 n 肌浆蛋白质量浓度/（μg/mL）空白组 3 71.70±0.90＊衰老模型组 3 71.13±1.59＊衰老糖尿病模型组 3 60.28±7.01参芪复方组 3 70.72±2.00＊西格列汀组 3 67.29±4.06＊

4.3 mTOR 磷酸化抗体芯片磷酸化位点图像

蛋白激酶B1（Akt1，Phospho-Thr450）、核糖体蛋白S6 激酶1/2/3/4（RSK1/2/3/4，Phospho-Ser221/227/218/232）及p70 核糖体蛋白S6 激酶（P70S6K，Phospho-Thr229）在衰老糖尿病模型组下调，在参芪复方组和西格列汀组均上调；人第10 号染色体缺失的磷酸酶（PTEN，Phospho-Ser370）在衰老糖尿病模型组上调，在参芪复方组和西格列汀组下调。 见表4、图1。

表4 mTOR 磷酸化抗体芯片读取的组间比较FC 值

5 讨论

5.1 病机及治则

脾主肌肉。 《素问·太阴阳明论》载：“脾病四肢不用何谓也……今脾病不能为胃行其津液，四肢不得禀水谷之气，气日以衰，脉道不利，筋骨肌肉皆无气以生，故不用焉。”言明脾运化不利，不能为胃行其津液，不能运化水谷精微以达四末，四肢不得禀水谷之气，致四肢脉道、筋骨、肌肉“无气以生”，失于气血之濡养，萎废不用。 脾主运化水谷精微功能受损，则四肢筋骨肌肉失于水谷精微、气血的滋养，导致骨骼肌肌量受损，出现肌肉瘦削、乏力、运动障碍、易跌倒等表现，如《灵枢·本神》言：“脾气虚则四肢不用。”故痿病本身源于脾虚失运，脾虚失濡，治疗尊“治痿独取阳明”，当健脾助运。

糖尿病归属中医学消渴范畴。 葡萄糖作为水谷精微之一，需脾运化至身体各处而被利用，施今墨言：“血糖者，饮食所化之精微也。”［7］脾的功能障碍则“脾不散精”或“散精不利”，导致葡萄糖不能被运化和利用，在血液中积累，形成糖尿病之高血糖。 故消渴的核心病机为脾气虚、脾不散精，健脾益气也同为消渴的治疗方法［8］。 消渴相关肌病以消渴为独特病因，病机同为脾气不足，治疗首当健脾益气。

肌少症是增龄性疾病，老年人为主要发病人群。老年人肾气虚，更赖脾胃化生气血以滋五脏，故衰老消渴相关肌病的治疗仍以益气健脾、助脾运化散精为要，兼顾补肾，健脾补肾并行［9］。 脾气不足，病理产物丛生，其中瘀血贯穿消渴始终，也是促进肌病发生发展的重要环节。 衰老消渴相关肌病的治疗方法为健脾益气、滋阴补肾、活血化瘀。

5.2 前期研究基础

参芪复方是临床治疗消渴的经验方，该方可改善大鼠的一般状况，降低大鼠食欲并减少饮水量，维持腓肠肌湿重，改善骨骼肌细胞炎症浸润、萎缩、水肿情况，其中对炎症细胞浸润的改善尤为明显［10-11］，并能显著升高血清胰岛素样生长因子1（IGF-1）水平。前期研究还显示，参芪复方维持骨骼肌肌量的作用可能与磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/mTOR 通路的激活相关［10，12］。

5.3 实验结果分析

骨骼肌蛋白质合成是维持肌量、肌力的关键因素。 本实验结果显示，参芪复方组肌浆蛋白含量显著高于衰老糖尿病模型组，组间比较差异有统计学意义。 肌浆蛋白是与能量代谢功能有关的蛋白质，占肌肉蛋白质的30%～35%，参芪复方升高肌浆蛋白质量浓度证明其可能通过促进蛋白质的合成以保持肌量。

mTOR 信号通路磷酸化抗体芯片数据读取结果显示，参芪复方上调Akt1（Phospho-Thr450）、P70S6K（Phospho-Thr229）、RSK1/2/3/4（Phospho-Ser221/227/218/232）。 Akt 介导的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1（mTORC1）激活通过磷酸化调节许多下游效应蛋白，包括具有良好特性的效应因子p70 核糖体S6 蛋白激酶1（P70S6K1）和真核细胞翻译起始因子4E 结合蛋白1（4E-BP1），以增加蛋白质合成［13］。 从Akt 激酶被磷酸化的顺序来看，苏氨酸450 号位点的磷酸化优先于丝氨酸473 号位点和苏氨酸308 号位点的磷酸化，而且已经被证明苏氨酸450 号位点的磷酸化是接下来继续磷酸化和激活Akt 激酶所必需的［14］。 P70S6K 的磷酸化增加，能够促进骨骼肌蛋白质合成，mTORC1/P70S6K 信号通路的磷酸化是一种促进骨骼肌蛋白质合成的重要因素［15］。 在IGF-1/Akt/mTORC1 信号通路中，Akt/mTOR 激活和P70S6K的后续磷酸化被认为是诱导蛋白质合成的原因［16］。RSK 已被证明是磷酸化160 kDa 的Akt/PKB 底物（AS160），AS160 是一种参与介导葡萄糖转运蛋白-4（GLUT4）转运到质膜以响应胰岛素的蛋白质［17］，RSK 磷酸化AS60，从而促进分子内GLUT4 蛋白向细胞膜迁移，促使葡萄糖从血液吸收到肌肉中储存和/或利用。 在骨骼肌中，胰岛素通过将GLUT4 葡萄糖转运体从细胞内转移到肌细胞膜上，刺激葡萄糖摄取，并增加肌肉质量和生长［18］。 Akt1（Phospho-Thr450）、P70S6K（Phospho-Thr229）、RSK1/2/3/4（Phospho-Ser221/227/218/232）的表达上调都能促进骨骼肌蛋白质的合成。

参芪复方可下调PTEN（Phospho-Ser370），PTEN作为胰岛素及IGF-1 信号调节器的作用，影响葡萄糖摄取和脂质代谢，PTEN 表达增加可负性调节胰岛素敏感性，并参与胰岛素抵抗的发生［18］。 参芪复方可能通过下调PTEN（Phospho-Ser370），改善衰老糖尿病大鼠的糖脂代谢。

综上，参芪复方通过升高肌浆蛋白质量浓度，促进蛋白质的合成以保持肌量，其分子机制可能与mTOR信号通路中Akt1（Phospho-Thr450）、P70S6K（Phospho-Thr229）、RSK1/2/3/4（Phospho-Ser221/227/218/232）的上调有关。

5.4 小结

脾主肌肉，肌肉形态结构和生理功能的正常，都与脾胃密切相关。 脾胃功能正常发挥更是延缓衰老、防治消渴及其并发症的根本。 mTOR 信号通路是调节蛋白质稳态的重要通路，通过感受能量代谢和运动刺激，参与调节蛋白质的合成代谢，进而维持骨骼肌肌量和肌力。 脾胃主运化受纳，将外来摄入的饮食水谷转化为精微的能量物质，布散于四肢肌肉，使四肢得以充养。 综上实验结果可知，参芪复方可能通过干预mTOR 信号通路、调控骨骼肌蛋白质合成代谢、维护骨骼肌能量代谢、保护骨骼肌肌量及肌力，而发挥防治衰老相关糖尿病肌少症作用。