加味补阳还五汤对术后腹腔粘连上皮-间充质转化和纤溶平衡的影响

王亚楠,范文江,詹倩倩,郑敏麟*

(1.福建中医药大学 中西医结合研究院,福建 福州 350122;2.福建中医药大学中西医结合学院,福建 福州 350122)

术后腹腔粘连(Postoperative abdominal adhesions,PAA)发生率高达90%以上,常发生在开腹手术后,PAA易导致慢性腹痛、肠梗阻、女性盆腔粘连而致不孕、增加再次手术难度等并发症[1]。前期研究证实加味补阳还五汤能够减少促纤维化因子-转化生长因子-β1(TGF-β1)蛋白的表达,抑制TGF-β1/Smad纤维化信号通路的激活,对术后腹腔粘连有较好的治疗作用[2]。本研究拟通过免疫组化法测定E-钙黏蛋白(E-cadherin,E-cad)、波形蛋白(Vimentin)、组织型纤溶酶原激活剂(Tissue-type plasminogen activator,t-PA)、纤溶酶原激活剂抑制剂-1(Plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1)、纤连蛋白(Fibronectin,FN)等蛋白在腹腔粘连模型大鼠的粘连处肠组织的表达情况,探讨加味补阳还五汤防治术后腹腔粘连的可能作用机制,使其能更好地应用于临床。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SD大鼠,性别为雄性,微生物级别为SPF级,数量为40只,年龄约为8周龄,体质量约(220±20)g,由福建中医药大学医学实验动物中心提供。许可号:SYXK(闽)2019-0007。大鼠正常活动,标准饲养环境(室温20～22℃,相对湿度60%～65%),标准饲料喂养,自由饮水,适应性喂养1周。

1.2 实验药物

均购自福建中医药大学附属第三人民医院,加味补阳还五汤组成:黄芪100g、桃仁15g、红花10g、川芎10g、当归10g、赤芍15g、地龙干10g、五灵脂15g、蒲黄10g、土鳖虫10g、炙甘草5g。用水提2次,每次1.5h,浓缩至稠膏状,每毫升含原生药21g。装瓶存放于-20℃冰箱备用,用时水浴加热至室温。

1.3 实验试剂与仪器

氯醛水合物(上海西格玛-奥德里奇贸易有限公司,货号:23100);透明质酸钠粉剂(北京索莱宝科技有限公司,货号:S8190)、伊红染色液(北京索莱宝科技有限公司,货号:G1100)、苏木素染色液(北京索莱宝科技有限公司,货号:G4530)、Masson三色染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司,货号:1340);免疫组化试剂盒(博士德生物有限公司,货号:SA1020)、DAB显色试剂盒(博士德生物有限公司,货号:AR1027);E-cad抗体(Chesion公司,货号:CPA1199);Vimentin抗体(Proteintech公司,货号:60330-1-lg);t-PA抗体(Abcam公司,货号:ab157469);PAI-1抗体(Novus公司,货号:NBP1-19773);FN抗体(Immunoway公司,货号:YT1733);石蜡包埋机(孝感亚光医用公司,型号:YB-7LF),石蜡切片机(LEICA公司,德国,型号:RM2235),摇床(海门麒麟医用仪器厂,型号:TS-1),电子天平(上海精科天平公司,型号:JA3003),光学显微镜(尼康公司,日本,型号:ECLIPSE511)。

1.4 实验分组及处理

按体质量给大鼠编号后,参照随机数字表法,将40只雄性SPF级SD大鼠,每组10只,分为4组,组别及处理如下:①正常组:灌胃蒸馏水21mL/(kg·d);②模型组:灌胃蒸馏水21mL/(kg·d)+注射1mL生理盐水;③加味补阳还五汤组(中药组):灌胃加减补阳还五汤21mL/(kg·d)+注射1mL生理盐水;④透明质酸钠组(HA组):灌胃蒸馏水21mL/(kg·d)+注射1mL 1%透明质酸钠凝胶。(注:中药组灌胃剂量为临床等效剂量)

正常组大鼠不进行造模。其余3组禁食但不禁水12h,参照参考文献[2-4]方法制作术后腹腔粘连模型:采用腹腔注射4%水合氯醛(10mL/kg)的方式麻醉大鼠,备皮、消毒,开腹后取出盲肠置于无菌纱布上,用缝合线打活结以结扎回结肠系膜动脉2min后再松开,引起肠暂时性缺血。然后用无菌砂纸摩擦盲肠右侧面浆膜(脏层腹膜)直至点状出血,注意避开血管以免造成大量出血,放置20min,使浆膜干燥。用锉刀损伤相应位置的壁层腹膜,形成粗糙的出血表面。然后将盲肠按解剖位置放回,并让脏层腹膜和壁层腹膜的伤口对齐,将两个伤口部位彼此接近。HA组关腹前在造模部位注射1mL 1%透明质酸钠凝胶,模型组、中药组关腹前在造模部位注射等量生理盐水,术后第2天,中药组灌胃加味补阳还五汤,模型组、HA组灌胃等量蒸馏水。连续灌胃28d后取材。

1.5 观察项目

1.5.1 镜下观察组织病理学变化 选取肠组织粘连部位制作石蜡切片,大鼠粘连肠组织固定、脱水、包埋。每块蜡块切6片后置于37℃烘箱过夜烤干,使用时二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱二甲苯、蒸馏水水合后,3片行HE染色、3片行Masson染色(按相应说明书操作),显微镜下双盲法观察肠组织粘连处病理学改变情况。

1.5.2 免疫组织化学法测定肠组织粘连处E-cad、Vimentin、t-PA、PAI-1、FN蛋白的表达 石蜡切片脱蜡至水合后,按免疫组化试剂盒操作,所用一抗各自稀释浓度为E-cad(1∶100)、Vimentin(1∶4 000)、t-PA(1∶200)、PAI-1(1∶200)、FN(1∶100),对粘连肠组织浆膜层E-cad、Vimentin、t-PA、PAI-1、FN蛋白的表达情况进行半定量观察,采用Image-Pro Plus 6.0分析蛋白表达情况。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 病理学观察结果

2.1.1 HE染色结果 正常组肠组织浆膜层结构完整,最外层腹膜间皮细胞(Peritoneal mesothelial cells,PMC)排列有序、连接紧密;模型组浆膜层有大量炎性细胞浸润、纤维结缔组织增生,PMC排列紊乱、连接松散;中药组浆膜层散在炎性细胞浸润,纤维结缔组织较少,PMC排列较模型组有序、紧密;HA组少量炎性细胞浸润,部分纤维结缔组织增生,PMC排列较模型组有序、紧密。见图1。

图1 粘连肠组织HE染色(×400)

2.1.2 Masson染色结果 正常组肠组织浆膜层结构完整,最外层PMC排列整齐、连接紧密;模型组浆膜层有大量胶原纤维增生(深蓝色),表示粘连程度较重,PMC排列紊乱、连接松散;中药组浆膜层散在胶原纤维增生(浅蓝色及浅紫色),表示粘连程度较轻,PMC排列较为有序、紧密;HA组浆膜层少量胶原纤维增生(浅蓝色及蓝色),粘连程度较模型组轻,PMC排列较为有序、紧密。见图2。

图2 粘连肠组织Masson染色(×400)

2.2 E-cad、Vimentin、t-PA、PAI-1、FN蛋白表达情况

2.2.1 E-cad、Vimentin表达情况 各组肠组织粘连处浆膜层E-cad、Vimentin蛋白表达结果:不同组别间,E-cad、Vimentin蛋白表达存在差异。正常组中E-cad高表达、Vimentin低表达。与正常组比较,模型组E-cad蛋白表达减少(**P<0.05),Vimentin表达增多(**P<0.05);与模型组比较,HA组和中药组E-cad蛋白表达增多(##P<0.05),α-SMA、Vimentin表达减少(##P<0.05)。这一结果表明HA及加味补阳还五汤均能增加E-cad的表达,降低Vimentin的表达,抑制PMC发生上皮-间充质转化(Epithelial to mesenchymal transition,EMT)。见图3、表1、图4。

表1 各组大鼠E-cad、Vimentin蛋白表达情况

注:a:与正常组比较**P<0.01,*P<0.05;b:与模型组比较##P<0.01,#P<0.05。

2.2.2 t-PA、PAI-1、FN的表达情况 各组粘连肠组织浆膜层t-PA、PAI-1、FN蛋白表达结果:不同组别间,t-PA、PAI-1、FN蛋白表达存在差异(均P<0.05)。正常组t-PA高表达,PAI-1、FN低表达。与正常组比较,模型组t-PA蛋白表达减少(**P<0.05),PAI-1、FN表达增多(**P<0.05);与模型组比较,HA组和中药组t-PA蛋白表达增多(##P<0.05),PAI-1、FN表达减少(##P<0.05)。这一结果表明HA及加味补阳还五汤均能增加t-PA表达,降低PAI-1的表达,维持纤溶平衡,从而使FN表达降低,减少粘连。见图5、表2、图6。

表2 各组大鼠t-PA、PAI-1、FN蛋白表达情况

3 讨论

术后腹腔粘连(PAA)是一种常于较大范围的盆腹部手术后,发生率高达90%以上,易导致慢性腹痛、肠梗阻、盆腔粘连等并发症的疾病[1]。

补阳还五汤合失笑散加土鳖虫、炙甘草,即为加味补阳还五汤,是治疗PAA的有效经验方。本课题组认为,PAA因在腹部手术后,元气大为亏损,气虚无力推动血液运行而致血瘀,瘀久则入络,故组方以补阳还五汤为主,大补术后亏虚之元气、活血通络;配伍专行腹部瘀血的失笑散而使其“补气活血”之功专注于腹部,地龙干、土鳖虫因其为虫类长于通络而逐瘀理伤,炙甘草调和全方诸药,使补阳还五汤和失笑散两方融为一体,专行腹部瘀血而擅治PAA。

图5 各组大鼠肠组织浆膜层t-PA、PAI-1、FN蛋白表达情况 (免疫组化×400)

注:a:与正常组比较**P<0.01,*P<0.05;b:与模型组比较##P<0.01,#P<0.05。

腹膜为覆盖在腹腔壁(壁层腹膜)及内脏器官(脏层腹膜)表面的浆膜,其主要成分为腹膜间皮细胞(Peritoneal mesothelial cells,PMC),是单层扁平的上皮细胞。PMC受到损伤时所发生的上皮-间充质转化(Epithelial to mesenchymal transition,EMT)被认为是PAA发生的重要机制[5]。EMT是指在某些特殊生理或病理条件下,具有极性、连接紧密的上皮细胞转化为具有运动能力以及连接松散间充质细胞的过程。

当受到创伤时,由PMC构成的壁层和脏层腹膜结构完整性遭到破坏,正常情况下会在接下来的5～7天完全修复[5],若腹膜受损严重,PMC会因无法及时修复而发生EMT,PMC(上皮细胞)形态发生肌成纤维样改变(间充质细胞)并与周围细胞连接松散,细胞中肌成纤维细胞标志物如α-SMA、I型胶原(Collagen-I)、Vimentin等表达也明显增加。而上皮细胞标志物如E-cad、紧密连接蛋白1(ZO-1)等表达明显下降;PMC原有的功能丧失,并且新生成的肌成纤维细胞会合成大量的胶原蛋白等结缔组织,导致细胞外基质(Extra cellular matrix,ECM)沉积,引起粘连[5-6]。

正常情况下,纤溶酶可以将纤维蛋白(包括胶原蛋白和纤连蛋白)分解为纤维蛋白降解产物(Fibrin degradationproducts,FDP)而使纤维蛋白沉积物降解,则PAA不会发生。纤溶酶是被t-PA激活和被PAI-1抑制激活的,t-PA在正常情况下主要是由PMC分泌的,它与PAI-1共同维持纤溶平衡,避免FN等纤维蛋白沉积物过度沉积[7-9]。当PMC受到严重损伤时,不能发挥其原有功能,t-PA分泌减少,PAI-1相对增多,造成纤溶失衡,FN不能被有效降解,FN过度沉积,而FDP减少[9-10],形成粘连带,导致永久性纤维粘连,则发生PAA。

本实验研究表明,加味补阳还五汤能够改善PAA大鼠肠组织粘连处的粘连情况,减少炎症细胞浸润,减少胶原纤维在浆膜层的堆积以减轻粘连,保护粘连处肠组织浆膜层PMC紧密连接的排列有序状态。本实验研究还表明,加味补阳还五汤可以降低粘连肠组织浆膜层PMC的Vimentin蛋白的表达,提高其E-cad蛋白表达,抑制浆膜层PMC发生EMT;同时,加味补阳还五汤还能降低浆膜层PAI-1蛋白表达,相应提高t-PA蛋白表达,维持纤溶平衡,从而减少FN蛋白表达,防止粘连的进一步形成,对术后腹腔粘连的防治起到良好的效果。本实验对课题组前期研究[2]进行了补充,说明加味补阳还五汤对术后腹腔粘连的治疗作用,可能是通过抑制浆膜层PMC发生EMT和改善纤溶失衡实现的。