苹果酵素的制备及其抗氧化功能研究

王虎玄, 柯西娜, 王 聪, 朱亚南, 孙宏民

(陕西科技大学 食品科学与工程学院, 陕西 西安 710021)

0 引言

自由基对人体健康具有较大负面影响.老年痴呆、动脉硬化、心脑血管疾病、糖尿病等多种慢性疾病的发生和发展,以及人体衰老均与体内自由基密切相关[1,2].大量自由基等氧化物负面影响蛋白质、DNA等胞内生物活性大分子的结构和功能,从而引发人体机能紊乱,产生病变.研究表明经常食用具有抗氧化功能的食品对预防和缓解由自由基引发的疾病具有良好的效果.因此,开发具有良好抗氧化活性的功能食品已成为国内外学者的研究热点[3,4].

植物酵素是以水果、蔬菜、谷物等为原料,通过微生物(乳酸菌、酵母、霉菌)发酵制备的富含生物活性成分(酶、维生素、矿物质以及次生代谢产物等)的新型功能性产品[5].植物酵素含有多种功能酶,如蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、超氧化物歧化酶(SOD)等;含有多种抗氧化类物质,如多酚类化合物、氨基丁酸等;含有多种风味物质,如芳香类化合物、多糖等;并含有其它活性物质,如功能多肽等[6].上述功能营养成分在植物酵素维持和保护人体健康方面发挥了重要作用.研究发现,植物酵素在抗氧化、清除自由基、活化细胞、平衡内分泌、提高身体免疫、美容养颜等方面具有良好功效,能预防和缓解多种急慢性疾病的发生和发展[7,8].人体细胞虽可合成少量酵素,但仍需通过日常膳食吸收补充才能使体内酵素实现动态均衡.体内酵素缺乏,可导致自由基氧化损伤、新陈代谢受阻等机体功能紊乱,从而产生急慢性病症[9].因此,植物酵素食品已成为风靡日本、欧洲等国家和地区的“明星”保健食品.我国也于2019年将食用酵素列为《产业结构调整指导目录》鼓励类产业.

苹果属蔷薇科苹果亚科,不仅富含多酚、类黄酮、膳食纤维、维生素等多种功能营养物质,而且具有抗氧化、抗癌、预防心血管及其它慢性疾病等作用.苹果是我国种植面积较广的农业资源,尤其在秦岭以北陕西宝鸡、咸阳、延安等地区分布广泛,已经作为支柱产业发展.总种植面积已超过1 000万亩,年产量在1 200万吨左右,资源十分丰富.目前,陕西苹果产业规模和产量稳居全国首位,已成为陕西农业的特色优势产业,也是乡村振兴的主导产业.虽然陕西苹果资源非常丰富,但开发利用状况相对落后,加工种类单一(主要是苹果浓缩汁),产值偏低,经济效益有限.苹果精深加工技术的落后,直接制约着高附加值产品的生产.为了破除上述产业弊端,并契合“面向人民生命健康”的产业发展趋势,以苹果为原料进行酵素生产具有良好的资源优势和开发价值.目前关于苹果酵素开发的研究已有报道,但大多采用单一菌种进行发酵[10,11].同时采用不同菌种组合发酵(如酵母菌+乳酸菌组合发酵)可以利用微生物之间互利共生关系而生成更丰富的代谢产物(如苹果中糖类物质作为碳源被酵母菌发酵利用,而其它组分可通过酵母菌代谢生成次生产物,如SOD前体物;进一步通过乳酸菌发酵可促进苹果酚类化合物形态转化等),克服单一菌种发酵不足的缺点,从而制备出具有更好生理活性的酵素,但这方面的报道较少[12,13].

本文以陕西洛川富士苹果为原料,以酵母菌和乳酸菌为发酵菌种,以SOD活力、总酸含量为主要指标,采用组合发酵方式,对影响酵母菌和乳酸菌发酵的工艺参数进行了优化,明确了苹果酵素发酵的最佳工艺条件,并对苹果酵素的抗氧化功能进行了初步分析.研究结果可为基于组合发酵改善苹果营养价值和功能特性提供理论支撑,也为高附加值苹果精深加工产品的开发提供技术支撑,经济效益和应用价值显著.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 主要材料

洛川富士苹果:选取大小均一、无病虫害、无机械损伤、成熟度相近、色泽一致的果实,苹果购买于西安本地超市;酿酒酵母、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌:均为食品级,由陕西科技大学食品科学与工程学院实验室提供.

1.1.2 主要试剂

酵母浸粉、葡萄糖、蛋白胨、琼脂、MRS肉汤培养基,购自北京奥博星生物技术有限公司;纤维素酶、果胶酶,购自上海源叶生物科技有限公司;NaOH、NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·12H2O、D-山梨醇、蔗糖、 浓盐酸、乙二胺四乙酸二钠、邻苯二甲酸氢钾、硫酸亚铁、福林酚等,均为分析纯,购自天津科密欧化学试剂有限公司;SOD试剂盒,购自上海碧云天生物技术有限公司.

1.2 主要仪器

SP-756P紫外可见分光光度计,上海光谱仪器有限公司;TDZ5-WS台式离心机,湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;PXY-DHS-500BS恒温培养箱,上海跃进医疗器械厂;SW-CJ-1F超净工作台,苏净集团-苏州安泰空气技术有限公司;pHS-25pH计,上海仪电科学仪器集团.

1.3 试验方法

1.3.1 苹果酵素制备工艺流程

新鲜苹果→切块匀浆→酶解→过滤→灭菌→调配→接种酵母菌→恒温发酵→接种乳酸菌→恒温发酵→4 ℃冷藏→苹果酵素

1.3.2 操作要点

(1)原料预处理

清水洗净苹果后去核、切块,打浆,然后添加复合酶制剂(果胶酶与纤维素酶比例3∶1)进行酶解.复合酶制剂添加量为0.05% w/v,酶解温度为55 ℃,酶解时间为2 h,洁净纱布过滤,滤汁高温灭菌处理[14].

(2)酵母菌活化

用适量无菌生理盐水溶解酿酒酵母菌粉,然后将菌液涂布于YPD固体培养基,并将培养基置于28 ℃恒温培养箱中培养2～3 d.挑取单菌落再次接种于10 mL YPD液体培养基中,并将液体培养基置于摇床(28 ℃,200 r/min)中培养24 h.

(3)酵母菌接种

取适量酵母菌菌液离心去上清,加入等量无菌生理盐水,然后接种至苹果汁(接种量1% v/v)中,28 ℃发酵20 h,定期通风以保证充分溶氧.

(4)乳酸菌活化

将鼠李糖乳杆菌与植物乳杆菌冻存液分别接种于适量MRS液体培养基中,并将液体培养基置于摇床(37 ℃,200 r/min)中培养12 h.吸取适量培养液再次接种于MRS液体培养基中培养12 h (接种量1% v/v).

(5)乳酸菌接种

取适量乳酸菌菌液离心去上清,加入等量无菌生理盐水,然后接种至已被酵母菌发酵20 h的苹果汁中(接种量1% v/v),37 ℃发酵20 h.

1.3.3 苹果酵素酵母菌发酵工艺优化

相对于酵母菌而言,乳酸菌更能快速有效地利用营养物质,因此在苹果酵素制备过程中,首先采用酵母菌发酵,然后进行乳酸菌发酵[15].

(1)发酵温度的考察

固定苹果汁中蔗糖添加量为6% w/v,苹果汁起始pH为4.0,酵母菌接种量为1% v/v,发酵时间为20 h,调节发酵温度分别为20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃进行发酵.发酵结束后测定苹果发酵液SOD活性,以确定最适的酵母菌发酵温度.

(2)发酵时间的考察

固定苹果汁中蔗糖添加量为6% w/v,苹果汁起始pH为4.0,发酵温度为30 ℃,酵母菌接种量为1% v/v,调节发酵时间分别为10 h、15 h、20 h、25 h、30 h进行发酵.发酵结束后测定苹果发酵液SOD活性,以确定最适的发酵时间.

(3)接种量的考察

固定苹果汁中蔗糖添加量为6% w/v,苹果汁起始pH为4.0,发酵温度为30 ℃,发酵时间为20 h,调节酵母菌接种量分别为0.5%、0.75%、1%、1.25%、1.5% v/v进行发酵.发酵结束后测定苹果发酵液SOD活性,以确定最适的酵母菌接种量.

(4)蔗糖添加量的考察

固定苹果汁起始pH为4.0,发酵温度为30 ℃,酵母菌接种量为1% v/v,发酵时间为20 h,调节苹果汁中蔗糖添加量分别为4%、5%、6%、7%、8% w/v进行发酵.发酵结束后测定苹果发酵液SOD活性,以确定最适的蔗糖添加量.

(5)苹果汁起始pH的考察

固定苹果汁中蔗糖添加量为6% w/v,发酵温度为30 ℃,酵母菌接种量为1% v/v,发酵时间为20 h,调节苹果汁起始pH分别为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0进行发酵.发酵结束后测定苹果发酵液SOD活性,以确定最适的苹果汁起始pH.

(6)苹果酵素酵母菌发酵响应面试验设计

基于单因素实验结果,选取发酵时间、发酵温度、苹果汁起始pH和蔗糖添加量四个因素,以SOD活力为响应值,进行四因素三水平的Box-Benhnken试验设计,研究苹果酵素酵母菌发酵的最优工艺参数.

1.3.4 苹果酵素乳酸菌发酵工艺优化

在酵母菌发酵一定时间后,苹果汁发酵液SOD活力达到最高时,分别接种鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌,进行乳酸菌发酵.

(1)发酵温度的考察

调节苹果发酵液pH为5.0,固定乳酸菌接种量为1% v/v,发酵时间为20 h,调节发酵温度分别为28 ℃、33 ℃、37 ℃、41 ℃、46 ℃进行发酵,发酵结束后测定苹果发酵液中乳酸菌数量和总酸含量,以确定乳酸菌的最适发酵温度.

(2)发酵时间的考察

调节苹果发酵液pH为5.0,固定乳酸菌接种量为1% v/v,发酵温度为37 ℃,调节发酵时间分别为10 h、15 h、20 h、25 h、30 h进行发酵,发酵结束后测定苹果发酵液中乳酸菌数量和总酸含量,以确定乳酸菌的最适发酵时间.

(3)接种量的考察

调节苹果发酵液pH为5.0,固定发酵温度为37 ℃,发酵时间为20 h,调节乳酸菌接种量分别为0.5%、0.75%、1%、1.25%、1.5% v/v进行发酵,发酵结束后测定苹果发酵液中乳酸菌数量和总酸含量,以确定乳酸菌的最适接种量.

(4)苹果发酵液起始pH的考察

固定乳酸菌接种量为1% v/v,发酵温度为37 ℃,发酵时间为20 h,调节苹果发酵液起始pH分别为6.1、6.3、6.5、6.7、6.9进行发酵,发酵结束后测定苹果发酵液中乳酸菌数量和总酸含量,以确定苹果发酵液的最适起始pH.

(5)苹果酵素乳酸菌发酵响应面试验设计

基于单因素实验结果,筛选发酵性能优良的乳酸菌进行响应面优化设计.选取发酵时间、发酵温度、苹果发酵汁起始pH三个因素,以发酵液总酸含量为响应值,进行三因素三水平的Box-Benhnken试验设计,研究苹果酵素乳酸菌发酵的最优工艺条件.

1.3.5 相关指标测定方法

(1)SOD活力

参考GB/T 5009.171-2003[16],使用SOD活力试剂盒(NBT法)进行检测.具体测定方法见试剂盒操作说明书.

(2)总酸含量

参考GB/T 12293-2021[17]中的方法测定.

(3)酵母菌浓度

采用血球计数板法测定.

(4)乳酸菌浓度

参考GB/T 4789.35-2016[18]采用MRS培养基进行平板接种计数,计算乳酸菌浓度.

(5)抗氧化性指标的测定

羟基自由基清除率、铁离子还原力以及总酚含量参考相关文献[19,20]中的方法进行测定.

1.3.6 数据处理

所有试验均进行3次重复,试验数据以均值±标准差表示.采用SPSS 12.0软件对试验数据进行方差分析+多重比较检验(p<0.05,Duncan′s-multiple-range-test)或者t检验(p<0.05).

2 结果与讨论

2.1 苹果酵素酵母菌发酵工艺优化结果

2.1.1 发酵温度的考察

随着菌种的不同,酵母菌最适生长温度一般介于20 ℃～30 ℃[21].从图1(a)可以看出,发酵温度为20 ℃时,可能温度过低导致本文所用的酵母菌株代谢速率减弱,因而发酵液SOD活力较低.随着发酵温度升高,酵母菌株代谢速率逐步加快,发酵液SOD活力随之逐渐增加.发酵温度达到30 ℃时,发酵液SOD活力达到峰值(143.07±2.01 U/mL).随着发酵温度进一步升高(达到35 ℃和40 ℃时),可能过高温度对酵母菌株代谢活性产生抑制作用,导致发酵液SOD活力快速降低.因此苹果酵素酵母菌发酵温度控制在30 ℃左右进行响应面试验.

2.1.2 发酵时间的考察

从图1(b)可以看出,随着发酵时间的延长,发酵液SOD活力呈现出先快速增加而后逐渐下降的趋势.发酵20～25 h后,酵母菌株可能已经充分代谢苹果汁中碳源物质生成SOD,SOD生成量达到峰值,因而发酵液SOD活力达到峰值(134.21±3.53 U/mL).随着发酵时间进一步延长(达到30 h时),发酵液SOD活力逐渐下降.这可能是由于SOD作为一类金属酶(含有Cu、Zn、Fe或Mn金属离子等作为辅基),酵母长时间代谢产生的过量Mn、Fe等金属离子对SOD活性产生抑制作用[22].因此苹果酵素酵母菌发酵时间控制在20 h左右进行响应面试验.

2.1.3 酵母菌接种量的考察

从图1(c)可以看出,随着酵母菌接种量的增加,发酵液SOD活力呈现出先快速增加而后缓慢下降的趋势.接种量介于0.5%～1.0% v/v时,随着接种量的增加,酵母菌代谢速率快速加大,因而发酵液SOD活力随之快速增加.接种量达到1.0% v/v时,发酵液SOD活力达到峰值(128.53±3.28 U/mL).接种量超过1.0% v/v后,发酵液SOD活力缓慢下降.这可能是由于接种量过高导致发酵液中酵母菌浓度大幅增加,苹果汁中有限含量的碳源等营养成分无法支撑酵母菌充分代谢,引发酵母菌株间对营养成分的争夺,酵母菌代谢活性受到抑制[23].此外,过高接种量可能引发酵母菌出现菌体自溶,活菌浓度降低导致代谢能力减弱,从而导致SOD活力降低[24].因此苹果酵素酵母菌发酵接种量控制在1.0% v/v为宜.

2.1.4 蔗糖添加量的考察

酵母菌的发酵特性与底物浓度、温度、pH等密切相关.由于鲜榨苹果汁糖含量(底物浓度)较低,影响酵母菌发酵性能.因此进行适当浓度外源糖分添加在促进酵母菌充分快速发酵,确保发酵终产品良好风味、口感、香气等品质形成方面具有重要作用.

为了确保酵母菌的充分发酵,本文采用蔗糖为酵母菌提供额外碳源成分.从图1(d)可以看出,随着蔗糖添加量的增加,发酵液SOD活力呈现出先快速升高而后快速下降的趋势.蔗糖添加量小于6.0% w/v时,随着蔗糖添加量增加,酵母菌代谢速率加快,发酵液SOD活力快速升高.蔗糖添加量达到6.0% w/v时,发酵液SOD活力达到峰值(123.69±2.93 U/mL).蔗糖添加量超过6.0% w/v后,发酵液SOD活力快速下降.分析认为蔗糖添加量过高会降低苹果汁水活度,抑制酵母菌代谢活性,从而导致SOD活性降低[25].

此外,本文虽未对发酵过程中外加糖分(蔗糖)的含量变化进行检测,但研究发现蔗糖添加量对发酵液SOD活力具有显著影响(如图1(d)所示),结合前人有关鲜食葡萄汁加糖发酵过程中外加糖分含量持续降低的结果,作者推测本文中苹果糖类物质以及外加糖分(蔗糖)均为酵母菌发酵的碳源.酵母菌先快速代谢苹果中主要单糖(果糖和葡萄糖),然后利用苹果中双糖及外加蔗糖持续发酵[26].综上,苹果酵素酵母菌发酵蔗糖添加量控制在6.0% w/v左右进行响应面试验.

2.1.5 苹果汁初始pH的考察

从图1(e)可以看出,苹果汁初始pH低于4.0时,发酵液SOD活力随着pH的增加而逐渐升高.苹果汁初始pH为4.0时,发酵液SOD活力达到峰值(122.53±1.42 U/mL).苹果汁初始pH超过4.0之后,发酵液SOD活力逐渐降低.培养基pH是影响微生物发酵的重要参数之一,对培养基营养物质稳定性、菌体生物酶活性维持、菌体细胞结构稳定等至关重要[27].研究表明,微酸性环境有利于酵母菌的生长代谢[28],推测pH 4.0(微酸性)是本文所用的酿酒酵母菌的适宜生长pH.因此苹果酵素酵母菌发酵苹果汁初始pH控制在4.0左右进行响应面试验.

图1 苹果酵素酵母菌发酵单因素试验结果

2.1.6 苹果酵素酵母菌发酵响应面试验结果

SOD酶活力(U/mL)=161.32+6.24a+1.01b-

2.00c-0.67d-6.50ab-0.29ac+2.31ad+

0.56bc-0.27bd-1.06cd-4.35a2-15.70b2-

19.54c2-23.37d2

(1)

式(1)中:a-发酵时间(h);b-发酵温度( ℃);c-蔗糖添加量(w/v);d-苹果汁起始pH.

基于上述回归方程,得到苹果酵素酵母菌发酵的理论最优工艺关键参数为:发酵温度28.87 ℃、发酵时间19.71 h、蔗糖添加量5.54% w/v、苹果汁初始pH 4.45,在此条件下模型预测的SOD活力为151.51 U/mL.考虑到实际操作,将上述工艺参数修改为发酵温度29 ℃、发酵时间20 h、蔗糖添加量5.5% w/v、苹果汁初始pH 4.5、酵母菌接种量1% v/v,此条件下3次重复试验的SOD活力为149.32±2.58 U/mL,与模型拟合理论值相近,说明响应面优化回归模型参数真实可靠.

表1 响应面试验设计和结果

表2 响应面模型的统计分析结果

2.2 苹果酵素乳酸菌发酵工艺优化结果

2.2.1 发酵温度的考察

从图2(a)可以看出,随着发酵温度的逐步升高,两株乳酸菌(植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌)代谢活性可能逐步加强,发酵液中乳酸菌浓度及总酸含量均逐步增加.发酵温度为37 ℃时,发酵液中乳酸菌浓度(鼠李糖乳杆菌:6.19±0.23 lg CFU/mL;植物乳杆菌:5.71±0.04 lg CFU/mL)及总酸含量(鼠李糖乳杆菌:3.65±0.47 g/L;植物乳杆菌:3.31±0.37 g/L)均达到峰值.进一步提高发酵温度,乳酸菌浓度及总酸含量均逐步降低.两株乳酸菌对比来看,在相同发酵温度下,鼠李糖乳杆菌各项指标值均优于植物乳杆菌,这可能与乳酸菌的发酵特性具有种属间差异相关[29].因此苹果酵素乳酸菌发酵温度控制在37 ℃左右进行响应面试验.

2.2.2 发酵时间的考察

从图2(b)可以看出,随着发酵时间的延长,两株乳酸菌持续代谢酵母菌发酵后苹果汁中营养成分产生大量有机酸,导致发酵液总酸含量持续增加.发酵20 h后,乳酸菌浓度与总酸含量的增加逐渐趋于平缓(鼠李糖乳杆菌浓度:6.10±0.18 lg CFU/mL;植物乳杆菌浓度:5.88±0.15 lg CFU/mL;总酸/鼠李糖乳杆菌:4.07±0.36 g/L;总酸/植物乳杆菌:3.95±0.26 g/L).在相同发酵时间下,鼠李糖乳杆菌各项指标值均优于植物乳杆菌.考虑到实际生产成本,苹果酵素乳酸菌发酵时间控制在20 h左右进行响应面试验.

2.2.3 接种量的考察

由图2(c)可以看出,随着两株乳酸菌接种量的增加,发酵液乳酸菌浓度和总酸含量均呈现增长趋势.接种量达到1% v/v后,乳酸菌浓度及总酸含量的增加趋于平缓(鼠李糖乳杆菌浓度:5.96±0.21 lg CFU/mL;植物乳杆菌浓度:5.78±0.14 lg CFU/mL;总酸/鼠李糖乳杆菌:3.94±0.29 g/L;总酸/植物乳杆菌:3.70±0.08 g/L).在相同接种量下,鼠李糖乳杆菌各项指标值均优于植物乳杆菌.考虑到实际生产成本,苹果酵素乳酸菌发酵接种量控制在1% v/v为宜.

2.2.4 发酵液初始pH的考察

由图2(d)可以看出,植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌发酵的最适pH介于6.3～6.7之间,在此pH范围内,发酵液乳酸菌浓度(鼠李糖乳杆菌:6.32±0.28 lg CFU/mL;植物乳杆菌:6.10±0.11 lg CFU/mL)和总酸含量(鼠李糖乳杆菌:4.16±0.36 g/L;植物乳杆菌:4.04±0.18 g/L)均达到峰值.发酵液初始pH低于或高于此范围,乳酸菌浓度和总酸含量均呈现出下降趋势.在发酵液初始pH相同条件下,鼠李糖乳杆菌各项指标值均优于植物乳杆菌.考虑到苹果汁中酵母菌发酵的可持续性,苹果酵素乳酸菌发酵发酵液初始pH控制在6.3左右进行响应面试验.

图2 苹果酵素乳酸菌发酵单因素实验结果

2.2.5 苹果酵素乳酸菌发酵响应面实验结果

表3 响应面试验设计与结果

表4 响应面模型的统计分析结果

通过Design-Expert软件对试验数据进行分析,得到二次多项回归方程如下:

总酸含量(g/L)=1.44-0.014a-0.013b+0.085c-0.013ab+0.007 2ac-0.002 7bc-0.14a2-0.17b2-0.17c2

(2)

式(2)中:a-发酵温度( ℃);b-发酵液初始pH;c-发酵时间(h).

基于上述回归方程,得到苹果酵素乳酸菌发酵的理论最优工艺参数为:发酵温度37.18 ℃、发酵时间23.12 h、发酵液初始pH 6.24,在此条件下模型预测的总酸含量为4.25 g/L.考虑到实际操作,将上述工艺参数修改为发酵温度37 ℃、发酵时间23 h、发酵液初始pH 6.2、乳酸菌接种量1% v/v,此条件下3次重复试验的总酸含量为3.98±0.34 g/L,与模型拟合理论值相近,说明响应面优化回归模型参数真实可靠.

2.3 苹果酵素发酵工艺优化结果

基于上述苹果酵素酵母菌和乳酸菌发酵工艺优化结果,得到苹果酵素发酵工艺关键参数如下:苹果汁中添加5.5% w/v蔗糖并调节苹果汁pH 至4.5,接种酿酒酵母进行发酵,发酵温度29 ℃,接种量1% v/v,发酵20 h后苹果汁发酵液SOD活力达到峰值(149.32±2.58 U/mL);而后调节发酵液pH至6.2、接种鼠李糖乳杆菌继续发酵,发酵温度37 ℃,接种量1% v/v,发酵时间23 h.制备的苹果酵素SOD活力为158.54±1.32 U/mL,酿酒酵母浓度为7.66±0.20 lg CFU/mL,鼠李糖乳杆菌浓度为6.47±0.14 lg CFU/mL,总酸含量为3.98±0.34 g/L.

2.4 苹果酵素抗氧化性结果

对最优工艺条件下制备的苹果酵素的抗氧化性进行了初步检测.由表5可以看出,苹果酵素羟基自由基清除率、铁离子还原力以及总酚含量相比于对照组(未发酵苹果汁)分别提高了90.70%、77.78%和93.23%, 说明酵母菌+乳酸菌分段发酵可大幅提高苹果汁抗氧化性.Karaman等[30]研究指出酚类物质能很容易地给出H+,并通过共振杂化而稳定,从而表现出较高自由基清除率.因此,酵素羟基自由基清除率的增强与酵素总酚含量的增加具有一定相关性[31].自由基清除率也与有机酸的羟基取代基、分子数量以及芳香环数量等密切相关[32].

本文虽然未对酵素总酸的具体成分进行检测,但查阅相关报道可知水果酵素中有机酸主要为乳酸、苹果酸、酒石酸、草酸、琥珀酸等,多种有机酸的综合作用可显著提高自有基清除力[33].此外,酵素中酿酒酵母细胞壁上的多糖也具有一定的自由基清除力[34].因此,苹果酵素表现出良好抗氧化性.与食品天然抗氧化剂(Vc和水溶性维生素E)以及合成抗氧化剂(BHA、BHT)相比,单菌(乳酸菌)发酵苹果汁的DPPH自由基清除率和羟基自由基清除率显著增强,但铁离子还原能力不及Vc[35,36].本文所采用的混菌发酵可以利用微生物之间互利共生关系进一步丰富苹果汁中微生物代谢产物,因此作者推测混菌(酵母菌+乳酸菌)发酵苹果酵素的抗氧化性强于Vc、BHT、BHA等食品抗氧化剂,但还需后期通过体外及体内试验进行充分验证.

表5 苹果酵素抗氧化功能结果

3 结论

本研究结合陕西地区农业经济特色,对陕西大宗水果资源-苹果酵素的发酵工艺进行了系统优化,并初步检测了酵素的抗氧化功能.通过单因素实验和响应面试验,明确了苹果酵素酵母菌发酵的最优工艺参数为:发酵温度29 ℃、接种量1% v/v、蔗糖添加量5.5% w/v、苹果汁初始pH 4.5,发酵20 h后苹果汁发酵液SOD活力达到峰值(149.32±2.58 U/mL);而后接种鼠李糖乳杆菌继续发酵,最优工艺参数为:发酵温度37 ℃、发酵液初始pH 6.2、接种量1% v/v、发酵时间23 h.此条件下制备的苹果酵素SOD 活力为 158.54±1.32 U/mL,酿酒酵母浓度为 7.66±0.20 lg CFU/mL,鼠李糖乳杆菌浓度为 6.47±0.14 lg CFU/mL,总酸含量为3.98±0.24 g/L.制备的苹果酵素羟基自由基清除率、还原力以及总酚含量相比于对照组(未发酵苹果汁)分别提高了90.70%、77.78%和93.23%,表现出良好的抗氧化性.研究结果为促进陕西大宗水果资源-苹果精深加工产业链的发展提供技术支撑.