猪繁殖与呼吸综合征病毒感染Marc-145 细胞的长链非编码RNA 和mRNA 转录组分析

张小霞，杨艳青，王秋云，杜俊阳，曹瀚文，梁振普

（河南农业大学生命科学学院，河南 郑州 450002）

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的一种母猪妊娠流产和仔猪呼吸困难的传染性免疫抑制疾病[1]，对全球养猪业造成了巨大的经济损失[2⁃3]。PRRSV 是单股正链RNA 病毒，基因组全长约15 kb，属动脉炎病毒科动脉炎病毒属的成员[4]。PRRSV 具有严格的细胞嗜性，能在猪肺泡巨噬细胞（PAM）、非洲绿猴胚胎肾上皮细胞（Marc-145）等细胞中增殖[5]。Marc-145细胞常被用于研究PRRSV 的感染机制及相关分子操控模式[6]。由于PRRSV具有突变率高、免疫抑制、持续感染且垂直传播、抗体依赖性增强作用以及中和抗体产生延迟等特征，目前尚无有效疫苗预防[7⁃9]。因此，亟待研发有效的治疗产品。

长链非编码RNA（Long non⁃coding RNA，lncRNA）是一类长度大于200 个核苷酸的非编码RNA，可能参与癌症等人类疾病的发生[10]，也可能参与宿主抗病毒反应的过程[11]。病毒入侵会引起自身或宿主产生lncRNA参与天然免疫应答[12]，从而调节宿主与病毒的相互作用。如lincRNA-Tnfaip3 充当NF-κB 共调节因子调节巨噬细胞炎性基因的表达[13]；lncRNA 肺腺癌转移相关转录本1（Malat1）抑制细胞核中DNA 结合蛋白（TDP43）的降解，从而抑制核干扰素调节因子3（IRF3）启动的抗病毒天然免疫[14]。

ZHANG 等[15]通过转录组测序技术（RNA-seq）对PRRSV 毒株GSWW/2015 和VR2332 感染24 h 的PAM 进行分析，发现lnc_000397 通过诱导干扰素刺激基因（ISG）的表达负调控PRRSV 复制。PRRSV抗原在感染Marc-145 细胞10～20 h 内可检测到，并在感染后3～4 d 出现细胞病变[16⁃17]。然而，关于lncRNA 在PRRSV 感染初期过程中的具体调控机制还有待研究。为探究PRRSV 感染Marc-145 细胞初期的lncRNA 和mRNA 的表达情况，对PRRSV 感染12 h的Marc-145细胞进行转录组测序，分析PRRSV感染后宿主细胞lncRNA 和mRNA 的表达谱变化及其二者的关联情况，筛选出PRRSV感染中潜在的候选lncRNA 和靶基因，以期为PRRS 的防治提供新的研究思路及药物靶点。

1 材料和方法

1.1 主要试验材料

Marc-145和PRRSV 经典毒株BJ-4均由河南省农业科学院动物免疫学重点实验室提供。胎牛血清（FBS）、0.25%-EDTA 胰酶、DMEM 培养基均购自北京索莱宝科技有限公司；24 孔板、一次性培养瓶购自Thermo Fisher 公司；TRIzol、SuperScript ⅡReverse Transcriptase 试剂购自Invitrogen 公司；TruSeq Stranded mRNA LTSample Prep Kit 试剂购自Illumina 公司；Agencourt AMPure XP 试剂购自Beckman Coulter 公司；Qubit RNA Assay Kit 和Qubit dsDNA Assay Kit 购自Life Technologies 公司；Bioanalyzer 2100 RNA-6000 Nano Kit 和Bioanalyzer 2100 DNA-1000 Kit购自Aglient公司。

1.2 样品制备

将Marc-145 细胞用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM 培养基培养，置于37 ℃、5%CO2培养箱中，分为2 组，一组为未接种PRRSV 的MARC-145 细胞的对照组，另一组为PRRSV 经典毒株BJ-4 感染12 h的试验组（MOI=1）。每组3 个重复，用于转录组测序。

1.3 总RNA的提取和质量检测

利用TRIzol 试剂提取总RNA，用1%琼脂糖凝胶检测RNA 降解和污染情况。分别用Nanodrop、Qubit 和Agilent 2100 检测总RNA 的纯度（OD260/280）、质量浓度和RNA 完整值（RNA integrity number，RIN）。

1.4 文库制备

样品检测合格后，以总RNA 为起始样品建立cDNA 文库。使用DNase 消化初始样品中的DNA后，用带有Oligo dT 的磁珠富集mRNA，加入打断试剂，将mRNA 打断成的短片段作为模板，用随机引物合成单链cDNA，然后配制双链合成反应体系合成双链cDNA，并使用试剂盒纯化双链cDNA；将纯化后的双链cDNA 进行末端修复、加A 尾、连接测序接头、片段大小选择，最后进行PCR 扩增得到cDNA文库。将构建好的文库用Agilent 2100 质检合格后，使用Illumina HiSeqTM2500测序仪进行测序。

1.5 raw reads质控、序列比对与转录本拼接

对测序得到的raw reads 进行质量评估，去除掉raw reads 中的少量带有测序接头、poly-N 以及测序质量较低的reads，并对测序错误率检查后得到后续分析使用的clean reads。用TopHat 2 软件对clean reads 进行参考基因组的比对分析，统计其可以mapping 到参考基因组的有效数据。使用HTSeq 软件对该物种每个样品进行已知类型基因的定量分析，根据表达量统计，得到样品中各类型基因的表达情况。利用TopHat 2 软件比对的结果进行转录本的拼接，可得到尽可能小的转录本集合，并对转录本定量分析。另外，还针对链特异性文库有特定的参数，可准确提供转录本链方向信息。

1.6 lncRNA和mRNA的筛选

lncRNA 是通过外显子筛选、转录本长度筛选、数据库已知转录本筛选、转录本表达量筛选、编码潜能预测等筛选得到，并将最终筛选到的lncRNA用于后续分析。

对lncRNA 的特征进行分析，将lncRNA 与mRNA 进行转录本长度、外显子（Exon）个数以及开放阅读框（ORF）长度对比，以此验证是否符合lncRNA的一般特征。

mRNA 是通过转录本外显子个数筛选、转录本长度筛选、转录本已知注释筛选以及编码潜能筛选等筛选得到，并将筛选出的mRNA用于后续分析。

1.7 差异表达lncRNA（DElncRNA）和差异表达RNA（DEG）的分析及DEG功能分析

使用Cuffdiff 软件将筛选到的lncRNA 和mRNA进行定量分析，得到各样本转录本的FPKM信息，以此估算基因表达水平。

基于lncRNA 和mRNA 的测序结果，以q-value<0.05 和|Fold change|>1.5 为显著性差异筛选条件进行差异表达分析。将显著差异的mRNA 进行GO 和KEGG 富集分析，GO 富集分析方法为GOseq，此方法 基 于 Wallenius non-central hyper-geometric distribution。

1.8 DElncRNA靶基因的预测及功能分析

将筛选到的显著差异表达的lncRNA 进行共表达预测mRNA，并将lncRNA 共表达mRNA 进行GO和KEGG富集分析。

1.9 DElncRNA靶基因和DEG的关联分析

在lncRNA共表达mRNA的KEGG富集分析中，以相关性排名前30通路中的mRNA 为筛选数据库，筛选出显著差异表达的mRNA，将其与关联的lncRNA 作为数据来源，使用Cytoscape 软件构建lncRNA和mRNA的互作网络。

2 结果与分析

2.1 RNA-seq测序样品的总RNA提取与质量检测

选取PRRSV 感染12 h 后的Marc-145 细胞为试验组（标记为M12_1、M12_2、M12_3），未经PRRSV感染的Marc-145 细胞为对照组（标记为M0_1、M0_2、M0_3）。提取6 组细胞的总RNA，利用Agilent 2100生物分析仪精准检测RIN评分，分别为9.9、9.5、9.7、10、9.8 和9.8。6 组样品RNA 的纯度、质量浓度和RIN 评分表明，提取的RNA 质量好，可用于后续试验。

2.2 PRRSV感染Marc-145细胞的转录组高通量测序和lncRNA鉴定

利用Illumina HiSeqTM2500平台对6组样品进行测序。从113 598 015.7 个raw reads 中获得106 397 660.7（93.66%）个clean reads。采用TopHat 2软件对clean reads进行参考基因组的比对分析。

使用Cuffdiff工具将拼接的转录本合并，得到本次测序完整的转录组信息，再将转录本集合进行lncRNA 的鉴定与筛选，经过5 个步骤的过滤，得到824 个已注释lncRNA 和419 个新lncRNA，所有lncRNA 具有相似的ORF 长度和外显子数量。与mRNA 相比，lncRNA 转录本较短，外显子数量较少，ORF较短，并且表达水平较低（图1）。

图1 lncRNA和mRNA的转录本分布（A）、外显子数量（B）和ORF长度（C）Fig.1 Transcript distribution（A），number of exons（B）and ORF length（C）of lncRNAs and mRNAs

2.3 基于RNA-seq的lncRNA差异表达分析和功能分析

以q-value<0.05 和|Fold change|>1.5 为显著性差异筛选条件对PRRSV感染组和对照组进行分析，结果显示，共有39 个差异lncRNA，其中19 个上调，20 个下调（图2A）。对差异表达的lncRNA 进行分层聚类分析，热图显示，与对照组中相比，PRRSV 感染组存在明显的自分离簇（图2B）。

为更好了解PRRSV 感染组与对照组中差异的lncRNA 的生物学功能，对lncRNA 共表达靶基因进行GO 和KEGG 富集分析。GO 分析结果显示，PRRSV 感染Marc-145 细胞中，与lncRNA 共表达的mRNA 在生物学过程（Biological process，BP）中主要与细胞代谢过程（Cellular metabolic process）和细胞含氮化合物代谢过程（Cellular nitrogen compound metabolic process）有关，在分子功能（Molecular function，MF）上主要与蛋白质结合（Protein binding）和细胞骨架蛋白结合（Cytoskeletal protein binding）有关（图2C）。

以q-value<0.05 为KEGG 富集分析条件，结果显示，PRRSV 感染组的lncRNA 共表达基因主要富集在MAPK 信号通路（MAPK signaling pathway）、胰岛素信号通路（Insulin signaling pathway）、碳代谢（Carbon metabolism）、HIF-1 信号通路（HIF⁃1 signaling pathway）和子宫内膜癌（Endometrial cancer）（图2D）。富集结果提示，PRRSV 可能通过lncRNA 调控靶基因的碳氮代谢或者MAPK 信号通路等营造宿主病毒的互作环境，这对深入解析lncRNA与PRRSV的关系有重要作用。

图2 基于RNA-seq的lncRNA的差异表达分析和lncRNA共表达mRNA的功能分析Fig.2 Differential expression analysis of lncRNAs and functional analysis of lncRNAs co-expressed mRNAs based on RNA-seq

2.4 基于RNA-seq的mRNA差异表达分析和功能分析

以q-value<0.05 与|Fold change|>1.5 为显著性差异筛选条件对PRRSV感染组和对照组进行分析，结果显示，共有1 320 个差异表达mRNA，其中552个上调，768 个下调（图3A）。对差异表达的mRNA进行聚类分析，结果显示，PRRSV 感染组与对照组中存在明显差异（图3B）。

为了更好地了解PRRSV 感染组与对照组之间差异表达mRNA 的生物学功能，对差异表达mRNA进行GO 和KEGG 富集分析。GO 富集分析结果显示，与对照组相比，PRRSV 感染组差异显著的mRNA 在分子功能上主要与氧化还原酶活性（Oxidoreductase activity）、醌或类似化合物受体（Quinone or similar compound as acceptor）有关；在细胞组分（Cellular component，CC）上主要与细胞内膜结合细胞器（Intracellular membrane⁃bounded organelle）和膜结合细胞器（Membrane⁃bounded organelle）有关；在生物学过程上主要与细胞对压力的反应（Cellular response to stress）、DNA 修复（DNA repair）、自噬（Autophagy）、对DNA 损伤刺激的反应（Response to DNA damage stimulus）、细胞含氮化合物代谢过程和有机环状化合物代谢过程（Organic cyclic compound metabolic process）有关（图3C）。

以q-value<0.05 为KEGG 富集分析条件，结果显示，与对照组相比，PRRSV 感染组差异显著的mRNA 主要富集在氧化磷酸化（Oxidative phosphorylation）、亨廷顿病（Huntington’s disease）、帕金森病（Parkinson’s disease）、非酒精性脂肪肝（Non⁃alcoholic fatty liver disease）、蛋白酶体（Proteasome）和碳代谢（图3D）。GO 富集结果提示，PRRSV 感染引起宿主细胞死亡与修复等应激反应；KEGG 富集结果提示，差异显著的基因与能量代谢通路和疾病信号通路有关，这些疾病的临床表征与PRRS 症状相似。因此，以能量代谢通路和疾病信号通路相关的基因为研究对象，有利于进一步研究PRRSV的致病机制。

图3 基于RNA-seq的mRNA的差异表达分析和功能分析Fig.3 Differential expression analysis and functional analysis of mRNAs based on RNA-seq

2.5 基于RNA-seq的DEG和DElncRNA靶标的关联分析

为了解差异表达lncRNA 的调控功能，对差异的lncRNA 共表达mRNA 进行预测和KEGG 功能分析，以rich factor、q-value 和富集基因数量为筛选条件，筛选出富集最显著的30条pathway条目，结果显示，与lncRNA共表达mRNA大部分富集在MAPK信号通路、内质网中的蛋白质加工（Protein processing in endoplasmic reticulum）、胰岛素信号通路、碳代谢、神经营养素信号通路（Neurotrophin signaling pathway）、AMPK 信号通路（AMPK signaling pathway）、HIF-1 信号通路和前列腺癌（Prostate cancer）等。为了阐明PRRSV 感染组lncRNA 与mRNA 的关系，使用Cytoscape 软件构建差异显著的lncRNA 和lncRNA 共表达mRNA 中富集最显著的30 条pathway 条目的交互网络（图4）。结果显示，1个lncRNA 可以对应不同的靶点，如XR_497637.1靶向超氧化物歧化酶1（SOD1）和热休克因子1（HSPB1）等，lncRNA XR_500765.1 靶向FOS，XR_494665.1靶向Jun等。

图4 基于RNA-seq的DEG和DElncRNA靶标的关联网络Fig.4 Association network of DEGs and DElncRNAs targets based on RNA-seq

3 结论与讨论

本研究通过对未感染和PRRSV 感染12 h 的Marc-145 细胞进行RNA-seq 高通量测序，揭示lncRNA 及其共表达的靶标可能在PRRSV 感染初期发挥的重要作用。经生物信息学分析，共有39个差异lncRNA 和1 320 个差异mRNA。为了解这些lncRNA 的调控功能，对差异的lncRNA 共表达的mRNA进行预测和功能分析，发现lncRNA共表达的mRNA 主要富集在MAPK 信号通路、AMPK 信号通路等。其中，HSPB1、Jun、FOS、SOD1等基因与PRRSV感染相关。

本研究中，与对照组相比，PRRSV 感染组lncRNA XR_500765.1 和XR_494665.1 的表达量均上调，同时预测其共表达的靶基因FOS和Jun的表达量也升高。通过KEGG 富集分析，发现FOS和Jun均参与MAPK 信号通路。MAPK 信号通路在细胞增殖、分化、凋亡、应激反应中发挥重要作用，与发育异常、肿瘤形成、癌症发生、自身免疫性疾病等有关[18]。细胞外信号调节激酶1/2（Extracellular signal⁃regulated kinase 1/2，ERK1/2）属于丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen⁃activated protein kinase，MAPK）家族，其过度激活是癌症发展的一个主要因素。ERK1/2可将细胞外信号传递到细胞内，通过磷酸化调节各种核内转录因子活性，如原癌基因FOS、Jun、Myc以及含ETS结构域的蛋白质Elk-1和cAMP依赖性转录因子ATF2[19]，从而促进细胞增殖、迁移、侵袭、耐药和转移的癌表型[20]，最终影响细胞的特定生物学效应。这提示PRRSV 感染机体后可能通过XR_500765.1和XR_494665.1促进FOS和Jun表达。研究表明，FOS 和Jun 可激活核转录因子AP-1 的转录[21]，从而进一步激活核基因的表达，以应对病毒的入侵。有研究报道，PRRSV 感染后也参与MyD88-ERK1/2-AP-1 信号通路[22]，这提示FOS和Jun在PRRSV 感染初期在MAPK 信号通路中发挥重要的调节作用。

PRRSV 感染可引起动物机体产生氧化应激反应[23]。研究表明，活性氧（Reactive oxygen species，ROS）和SOD 在生物体氧化与抗氧化平衡中起重要作用[24]。本研究中，PRRSV 感染Marc-145 细胞后，lncRNA XR_497637.1 表达量下调，预测其共表达的靶标SOD1的表达量降低，推测lncRNA 可能作为内源竞争RNA（ceRNA）竞争性结合miRNA，从而调控miRNA 的靶标，导致SOD1表达下调，这可能进一步影响PRRSV的复制。ROS尤其是超氧化物的产生，是杀死入侵病原体的重要宿主防御机制，抗氧化剂SOD 含量降低可能会抑制机体对病毒感染产生的氧化应激反应，对机体起到保护的作用。但也有报道病毒感染引起机体免疫过度，ROS 大量表达造成免疫损伤，导致机体免疫功能下降，从而引起病毒复制能力增强[25]。LEE 等[26]研究发现，PRRSV 感染Marc-145 细 胞 后 ，ROS 含 量 增 加 ；CHARERNTANTANAKUL等[27]研究发现，PRRSV 感染PAM 12 h 后，PAM 中O2-·和H2O2含量增加。这与本研究中PRRSV 感染Marc-145 细胞后预测lncRNA XR_497637.1 共表达的SOD1表达下调一致。XU 等[28]研究发现，在肝癌细胞中，lncRNASNHG14表达量上调后，通过结合miRNA-217，直接靶向上调IGF1R和KLF5表达量，以促进癌细胞的增殖。前人研究表明，lncRNACTC-497E21.4 与miR-22 竞争以调节NET1的表达，并通过RhoA 信号通路调节胃癌的恶性进展[29]。LNC00689 直接与miR-338-3p 相互作用促进丙酮酸激酶M2（PKM2）的表达，发挥ceRNA 的作用[30]。这与本研究中lncRNA XR_497637.1 可能作为ceRNA 竞争性结合miRNA，导致SOD1表达量下调的预测结果一致。本研究中，PRRSV 感染Marc-145 细胞12 h 后lncRNA XR_497637.1 表达下调，预测其共表达的HSPB1的表达量下调。

综上，本研究对差异表达的lncRNA 和mRNA进行功能分析，以及差异表达的lncRNA 与mRNA联合分析，筛选出PRRSV 感染中潜在的候选lncRNA 和靶基因，如lncRNA XR 靶向500765.1 靶向FOS、XR_494665.1 靶向Jun、XR_497637.1 靶向SOD1、HSPB1。下一步可以对这些lncRNA 和靶基因进行缺失和过表达的功能研究，以便进一步了解lncRNA 在PRRSV感染宿主中的作用，为PRRS的治疗提供新的研究思路。