银鼓鱼海豚链球菌的分离、鉴定及毒力基因检测

2023-05-19杨林狄贾新蕾黄增朝吕静梁华芳黄郁葱

大连海洋大学学报 2023年2期

杨林狄，贾新蕾，黄增朝，吕静，梁华芳，黄郁葱*

(1.广东海洋大学水产学院，广东湛江 524088；2.广东省水产动物病害防控与健康养殖重点实验室，广东湛江 524088；3.广东高等学校水产经济动物病害控制重点实验室，广东湛江 524088)

银鼓鱼(Selenotocamultifasciata)，又称为多纹钱蝶鱼，隶属于辐鳍鱼纲(Actinopterygii)鲈形目(Perciformes)金钱鱼科(Scatophagidae)，广泛分布于澳大利亚、菲律宾和泰国等地的江河入海口，在中国东海南部至南海，以及北部湾区域亦有分布，该鱼栖息于海湾、河口、红树林及淡水河流和小溪的下游，目前，已开始在广东省、海南省和广西壮族自治区的网箱和池塘中大量养殖。银鼓鱼属于偏植食性的杂食性海水鱼类，具有耐高温和广盐的特性，其肉质嫩滑鲜美，深受广大消费者的喜爱，是一种兼具观赏和食用价值的重要经济鱼类。有关银鼓鱼的研究报道，主要涉及其胚胎发育、胚后发育观察[1-2]及对其完整线粒体基因组的测序[3]等方面，但对银鼓鱼的病害研究鲜见报道，仅见罗璋等[4]从天津某观赏鱼养殖场银鼓鱼中分离出一株海豚链球菌(Streptococcusiniae)。

2021年，北部湾地区银鼓鱼养殖场病害频发，造成大批量死亡。本研究中，对现场采集的患病银鼓鱼进行病原菌的分离鉴定，并全面开展了组织病理学、人工感染、毒力基因检测及药物敏感性等较为系统的研究，以期为后续北部湾地区银鼓鱼养殖中的病害防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

患病银鼓鱼于2021年分别采自广东省湛江市坡头区南三镇、廉江市和广西北海市的3个不同养殖场，从每个养殖场采集3尾，体长为(18±4)cm。回归感染试验用健康银鼓鱼体长为10～15 cm，购自湛江市某养殖场。

试剂：BHI液体培养基、BHI琼脂培养基、M-H血琼脂培养基和革兰氏染色试剂均购自青岛海博生物技术有限公司；血琼脂平板培养基购自广州环凯微生物有限公司；HE染色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；PCR所用试剂购自宝生物(大连)有限公司；细菌生化微量鉴定管、药敏纸片购自杭州滨和微生物试剂有限公司；细菌DNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成；海豚链球菌ATCC29178株购自美国ATCC菌种保藏中心。

1.2 方法

1.2.1 组织病理学观察取自然感染发病银鼓鱼的脑、心和肝脏等组织，迅速置于体积分数为10%的中性福尔马林中，固定24 h后，用乙醇进行梯度脱水，二甲苯透明、石蜡包埋后进行切片(4～6 μm)，使用HE染色剂试剂盒进行染色，用中性树胶将切片封藏于玻片上，在显微镜下观察并对典型病变组织进行拍照。

1.2.2 病原菌的分离纯化用体积分数为75%的乙醇棉球反复擦拭患病银鼓鱼体表后，在无菌条件下进行解剖，观察记录其内部器官的病症，取其脑、脾脏和肝脏组织，用无菌水冲洗、研磨，划线接种于BHI琼脂培养基，倒置于生化培养箱，28 ℃下培养24～48 h后，挑取优势单菌落在BHI琼脂培养基上反复划线纯化2～3次，获得纯化菌株。挑取纯化后的菌落于BHI液体培养基中扩大培养，并进行后续鉴定工作。

1.2.3 分离菌株的鉴定

1)菌落和菌体形态观察。用接种环挑取纯化后的单菌落，接种于血琼脂平板培养基上，倒置于生化培养箱，在28 ℃下培养24～48 h后，挑取单菌落制备菌液涂片，使用革兰氏染色试剂进行染色，观察其菌落形态及菌体形态并进行拍照。

2)生理生化鉴定。挑取纯化后的单菌落接种于细菌微量生化反应管中，倒置于生化培养箱，在28 ℃下培养24～48 h，以参考菌株ATCC29178作为阳性对照，根据《伯杰氏系统细菌学手册》[5]对菌株培养结果进行初步鉴定。

3)16S rRNA序列分析。利用细菌DNA提取试剂盒提取分离菌株的DNA，使用细菌16S rRNA通用引物27F(5′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3′)和1492R(5′GGTTACCTTGTTA CGACTT 3′)对分离菌株的16S rRNA基因进行扩增。PCR体系(20 μL)：上、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，Ex-Taq 10 μL，用ddH2O补足至20 μL。PCR反应程序：95 ℃下预变性5 min；95 ℃下变性30 s，56 ℃下退火1.5 min，72 ℃下延伸1 min，共进行36个循环；最后在72 ℃下再延伸5 min。PCR产物经电泳检测验证后送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。将分离菌株的16S rRNA序列与GenBank数据库中已知核酸序列进行BLAST分析。采用MEGA 5.0软件，将分离株(BBW S1、BBW S2和BBW S3)与其他细菌的16S rRNA核苷酸序列一起构建系统发育树，节点的置信度检验采取Bootstrap分析(1 000个循环)。

1.2.4 人工回归感染试验回归感染试验于广东海洋大学海洋生物研究基地室内养殖桶(体积为0.1 m3)中进行，水温控制在28 ℃，24 h持续充气，每天换水量为1/3，每日投喂两次商品配合饲料。将分离获得的菌株接种于BHI液体培养基，培养18～24 h后，用无菌PBS制成不同浓度的菌悬液。试验前随机取5尾实验室暂养14 d的健康银鼓鱼进行解剖，检测确认其无细菌、寄生虫和病毒感染后，将试验鱼随机分为6组，每组30尾。试验组银鼓鱼每尾腹腔注射0.2 mL浓度分别为1.5×104、1.5×105、1.5×106、1.5×107、1.5×108CFU/mL的菌悬液，对照组注射等量无菌PBS。接种后观察并记14 d内鱼的发病死亡情况，及时剖检濒死试验鱼，并再次对其致病菌进行分离鉴定。使用改进的寇氏法[6]计算半数致死量(LD50)。

1.2.5 海豚链球菌主要毒力基因的PCR检测毒力基因pgmA和cfi的引物参照熊向英等[7]的方法设计合成，其余毒力基因scpI、simA、pdi、sagA和cpsD的引物参照Baums等[8]的方法设计合成。用PCR检测分离菌株携带scpI、simA、pdi、sagA、cpsD、pgmA和cfi7个主要毒力基因的情况，各毒力基因的引物序列、目的片段大小及退火温度见表1。PCR体系20 μL，同“1.2.3节”16S rRNA的PCR扩增。PCR反应程序：95 ℃下预变性5 min；95 ℃下变性30 s，按各基因的退火温度(表1)，退火1 min，72 ℃下延伸1 min，共进行36个循环；最后在72 ℃下再延伸5 min。取5 μL PCR扩增产物，用10 g/L琼脂糖凝胶进行电泳，检测PCR扩增反应产物和长度。

1.2.6 药敏试验采用K-B法[9]测定分离菌株对18种抗菌药物的敏感性。将分离菌株菌悬液浓度稀释至 1.0×108CFU/mL，均匀涂布于M-H血琼脂培养基，贴上药敏纸片，倒置于生化培养箱，在28 ℃下培养24 h后，使用游标卡尺测量抑菌圈大小，并按照产品说明书判定菌株的耐药性，试验设置3个重复并取其平均值。

2 结果与分析

2.1 患病银鼓鱼的临床症状

患病银鼓鱼离群独游，靠岸打转，体表特征为腹部肿胀，鳍基部充血发红(图1A)，眼球突出、充血(图1B)；剖检发现，肠道内有积水或黄色黏液，肝脏萎缩、发黄(图1C)。

A—鳍基部充血发红；B—眼球突出、充血；C—肠道积液、肝脏萎缩。A—red and congested fins；B—exophthalmos and hyperemia；C—intestinal effusion and liver atrophy.图1 患病银鼓鱼的临床症状Fig.1 Clinical syndrome of diseased Selenotoca multifasciata

2.2 组织病理学变化

对患病银鼓鱼进行组织病理观察发现，各组织器官均有不同程度的病变。患病的银鼓鱼脑膜增厚，伴随着毛细血管充血，大量淋巴细胞浸润(图2A)，且脑膜疏松水肿(图2B)；眼球的脉络膜血管细胞崩解、脱落(图2C)；心外膜增厚且伴随着炎性细胞浸润(图2D)；肝实质出现空泡变性，肝细胞有多灶性坏死(图2E)；脾实质组织多处液化坏死、疏松(图2F)，伴随着充血，炎性细胞浸润；肾小管萎缩、溶解 (图2G)；鳃基部细胞增生伴有充血(图2H)；肠道出现空泡样结构，肠黏膜破裂受损(图2I)。

2.3 病原菌分离鉴定

2.3.1 病原菌分离与形态学观察从湛江市南三镇、廉江市和北海市3个不同养殖场的患病银鼓鱼组织中分别分离得到1株优势菌株，命名为BBW S1、BBW S2和BBW S3。3株分离菌株在BHI培养基中培养24 h后，均形成圆形、中央隆起、边缘光滑、直径约为0.7 mm的乳白色菌落，同时在血琼脂平板培养基上生长产生β溶血(透明溶血环)的菌落(图3A)，经革兰氏染色后镜检观察，均为紫色链状革兰氏阳性菌(图3B)。

A—血琼脂平板菌落形态；B—革兰氏染色后菌体的显微观察。A—colony morphology on blood agar；B—microscopic observation of bacterial strains after Gram staining.图3 分离菌株的菌落和菌体形态特征Fig.3 Colony and morphological characteristics of isolated strains

2.3.2 生理生化鉴定从表2可见，3株分离菌株在10 ℃不生长，在37、45 ℃生长，溶血类型为β溶血，均可发酵麦芽糖、木糖、七叶苷、葡萄糖和蔗糖，不发酵甘露醇、山梨醇、乳糖、棉子糖和阿拉伯糖，V-P试验、触酶试验、赖氨酸、鸟氨酸、β-半乳糖苷酶和H2S检测呈阴性，精氨酸双水解酶呈阳性。其结果与阳性对照组ATCC29178基本一致，符合海豚链球菌的生化特性。

表2 病原菌部分生理生化特征Tab.2 Selected physiological and biochemical characteristics of pathogenic bacteria

2.3.3 16S rRNA序列分析使用细菌16S rRNA通用引物对分离菌株BBW S1、BBW S2和BBW S3进行PCR扩增后，均获得预期大小约为1 500 bp的基因片段(图4)。将测序得到的序列使用BLAST进行比对，结果显示，均与海豚链球菌的同源性最高，一致性均达到99%以上。系统进化分析显示，分离菌株BBW S1、BBW S2和BBW S3与S.iniae亲缘关系最近(图5)。

综合分离菌株的形态特征及生理生化特性，并结合16S rRNA序列、BLAST比对及系统发育分析结果，判定3株分离菌株BBW S1、BBW S2、BBW S3均为S.iniae。

2.4 人工回归感染试验

从表3可见，3株分离菌株的LD50分别为3.75×105、7.11×105、4.85×105CFU/mL。试验鱼感染发病的症状与自然感染发病的银鼓鱼相似，从感染发病死亡的银鼓鱼体中再次分离细菌，均与原分离菌的形态特征一致，经16S rRNA鉴定仍为S.iniae。因此，确定3株分离菌株均为引起3个地区人工养殖银鼓鱼暴发性死亡的病原菌。

表3 银鼓鱼人工感染试验结果Tab.3 Results of artificial infection of Selenotoca multifasciata

2.5 海豚链球菌主要毒力基因的PCR检测

对3株海豚链球菌的scpI、simA、pdi、sagA、cpsD、pgmA和cfi7种毒力基因进行PCR检测，均扩增出了预期大小的片段(图6)，这表明3株海豚链球菌均含有以上7种主要的毒力基因。

M—DL2000 DNA marker；1-7—scpI，simA，pdi，sagA，cpsD，pgmA and cfi genes.图6 海豚链球菌主要毒力基因的PCR检测Fig.6 PCR detection of major virulence genes of Streptococcus iniae

2.6 药敏检测

采用纸片扩散法检测分离菌株对氟苯尼考和恩诺沙星等18种抗菌药物的敏感性，结果如表4所示，3株分离菌株均对阿莫西林、四环素、盐酸多西环素、恩诺沙星、氧氟沙星、呋喃妥因、环丙沙星和多黏菌素B敏感，对头孢噻吩、青霉素G、红霉素等耐药，对氨苄西林、头孢他啶、庆大霉素、大观霉素、氟苯尼考、万古霉素和卡那霉素等有不同程度的敏感性。

表4 菌株的药物敏感性试验结果Tab.4 Drug susceptibility results of bacterial strains

3 讨论

3.1 病原菌的分离鉴定

从20世纪70年代开始，世界范围内就陆续有链球菌侵染鱼类导致死亡的案例报道，至今链球菌依旧是水产养殖动物患病的主要病原菌。海豚链球菌由Pier等[10]从亚马逊淡水海豚中首次分离得到，故被命名为海豚链球菌。Kitao等[11]于20世纪80年代首次报道海豚链球菌感染鱼类，并在患病的虹鳟(Oncorhynchusmykiss)、香鱼(Plecoglossusaltivelis)和尼罗罗非鱼(Oreochromisnilotica)中分离出海豚链球菌。迄今为止，海豚链球菌广泛流行于中国、美国、新加坡、日本、加拿大和澳大利亚等世界各地水域，可感染多种淡水、海水养殖品种及野生鱼类，导致鱼类大量死亡，对全球水产养殖业造成了巨大的经济损失。此外，海豚链球菌还能够威胁人类的健康与安全，目前，已有多例人感染海豚链球菌的报道。在中国已有海豚链球菌感染罗非鱼(O.niloticus)[12]、卵形鲳鲹(Trachinotusovatus)[12-13]和斑点叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)[14]等相关报道。本研究中，从3个养殖场的患病银鼓鱼中共分离得到3株优势菌BBW S1、BBW S2和BBW S3，通过菌株形态学、生理生化试验、16S rRNA序列分析和回归感染试验，鉴定其均为海豚链球菌，这与罗璋等[4]的研究结果一致，说明银鼓鱼是海豚链球菌的天然宿主。

3.2 海豚链球菌对银鼓鱼的致病性

鱼类感染海豚链球菌后的主要临床症状为眼球突出、全身性败血、心包炎及脑膜炎等[15]。脾脏和肾脏是鱼类重要的免疫器官，银鼓鱼感染海豚链球菌后，肾脏和脾脏严重损伤，进一步降低了银鼓鱼的防御能力，并引发多器官发生病变。本研究中，患病银鼓鱼出现脑膜增厚、疏松水肿等特征性病变，表明海豚链球菌能够突破银鼓鱼血脑屏障进入中枢神经系统，引起脑膜炎，其与鲟(Acipensersinensis)[16]、罗非鱼[17]感染海豚链球菌的病理特征相似。此外，本研究中发现，患病银鼓鱼的肝脏、鳃和肠道均有损伤，表明海豚链球菌通过血液循环到达各组织器官，导致多器官功能受损，最后致鱼器官衰竭死亡。

本研究中，人工回归感染试验显示，BBW S1、BBW S2和BBW S3的LD50分别为3.75×105、7.11×105、4.85×105CFU/mL，且受感染的银鼓鱼与自然发病银鼓鱼症状相似，说明3株海豚链球菌均对银鼓鱼具有较强的致病性。3株分离菌株间的LD50与杂交鲟源海豚链球菌的LD50(1.20×105CFU/mL)[18]及西伯利亚鲟(Acipenserbaerii)源海豚链球菌的LD50(3.20×106CFU/mL)[19]值存在差异，说明海豚链球菌株的致病性与菌株来源、宿主种类和大小等有关。

3.3 银鼓鱼海豚链球菌的毒力基因检测

海豚链球菌编码的大量毒力因子与其致病机制密切相关，在细菌黏附、定植、侵入和体内增殖及免疫逃逸等方面起着重要作用。研究表明，链球菌的致病力取决于细菌在宿主免疫细胞中的存活，以及感染、诱导细胞凋亡的能力[20]。simA基因编码的M蛋白是高度保守的毒力因子，在海豚链球菌的致病过程中起着重要作用，能够为海豚链球菌提供抗吞噬细胞的吞噬作用，有助于海豚链球菌对细胞的黏附和侵染[21]；sagA基因编码的溶血素S是目前已知最有效的细胞毒素之一[22]，能够破坏红细胞、血小板、中性粒细胞和淋巴细胞等细胞膜，以及线粒体、溶酶体等亚细胞器[23]；scpI基因编码的C5a肽酶能够水解中性粒细胞化学诱导物补体因子C5a，有助于海豚链球菌黏附宿主上皮细胞[21]；pdi基因编码的脱乙酰基酶能够使海豚链球菌对溶酶体产生耐受，增强海豚链球菌对宿主细胞的黏附和入侵能力[24]；cps编码的荚膜多糖能够调节和抑制吞噬细胞的吞噬，阻止宿主补体因子C3a的沉积，也能增强溶血素S的生成[25]；pgmA基因编码的葡萄糖磷酸变位酶对海豚链球菌的毒力至关重要，在维持正常的细胞壁形态、荚膜表达和抵抗先天免疫清除机制中发挥作用，参与细胞壁和荚膜生物合成，并能抵抗阳离子抗菌肽[26]；cfi基因编码的CAMP因子能使海豚链球菌以两种方式侵害宿主机体，第一种是协同其他能够分泌鞘磷脂酶的细菌溶解宿主细胞膜，第二种是结合免疫球蛋白Fc片段，拦截抗体向补体释放抗原[27]。海豚链球菌的致病力完全取决于其毒力因子，对菌株致病力的判断可以通过检测毒力因子加以辨别[28]。本研究中，对海豚链球菌7种主要毒力基因进行PCR检测，均能扩增出相应大小的条带，这与熊向英等[7]对卵形鲳鲹源海豚链球菌及白明焕等[29]对鲟源海豚链球菌的毒力基因检测结果高度相似，均含有上述毒力基因，表明3株海豚链球菌均为强毒株型。

3.4 海豚链球菌病的防治

鱼类链球菌病的发生是由环境、宿主和病原菌共同作用的结果，对其防治措施主要包括改善养殖水环境、免疫预防和药物治疗等方法。接种疫苗是预防链球菌病的有效方法，目前研发的海豚链球菌疫苗主要有灭活疫苗、减毒疫苗、亚单位疫苗和DNA疫苗。如王静波等[30]利用分离自患病杂交鲟的海豚链球菌制备灭活疫苗免疫杂交鲟，其相对保护率(RPS)高达92.8%；Locke等[21]将构建的海豚链球菌△simA突变菌株作为减毒疫苗，对条纹鲈(Moronesaxatilis)和斑马鱼(Daniorerio)均显示出较好的保护效果。目前，国外已有商品化的海豚链球菌疫苗。在养殖生产中，使用抗菌药物来预防和治疗细菌类疾病是最为简单和便捷的方法，药物敏感性试验对临床合理选择抗菌药物不仅具有重要的指导意义，而且能够避免因滥用抗生素而导致细菌的耐药性增强，减少多重耐药性菌株的产生。本研究中，自患病银鼓鱼分离的3株海豚链球菌均对恩诺沙星、盐酸多西环素等8种抗菌药物敏感，参考2020年6月农业农村部发布的最新《水产养殖用药明白纸》，银鼓鱼发病后，可采用水产用盐酸多西环素、恩诺沙星粉对银鼓鱼海豚链球菌病进行治疗。对于不同规格和养殖环境的患病银鼓鱼，其给药途径、剂量和间隔时间等尚需要进一步研究，以便制定合理方案，确保科学用药。此外，应鼓励开发绿色和安全的防治技术，如开发免疫调节剂、益生菌和中草药等绿色抗生素替代药物。