中药复方芪明颗粒“眼肾同治”糖尿病视网膜病变和糖尿病肾病的网络药理学及分子对接研究△

周茹玉 罗向霞 洪卓民 曾 敏 邓 梦 杨 芮 郑菀睿

糖尿病视网膜病变(DR)和糖尿病肾病(DN)是全球工作年龄人群致盲和世界上终末期肾病致死的主要原因[1]。西医临床研究认为,早期注重优化代谢的基础治疗联合专科治疗是目前防治二者的重要策略[2-3]。不过漫长的治疗周期和突出的不良反应不但加重了经济负担,而且降低了患者的依从性。相反,中医学在DR和DN治疗方面取得了显著成就。中医学认为,DR和DN均为消渴病久病不愈引起的并发症,气阴两虚、脉损络阻是推动二者疾病演变的关键病因病机,治疗时应运用益气养阴通络之法。此外,“眼肾同治”治法是前人基于肝肾同源理论论治DR和DN时提出的,既往文献研究指出这一治法可能是未来中医药防治DR和DN的新思路[4]。

芪明颗粒擅长益气养阴、补肝益肾、通经活络。方中黄芪甘温色黄以振奋中土,温补五脏,调护三焦,使五脏六腑之精气皆上注于目而目珠得养;葛根、枸杞子、决明子、茺蔚子、蒲黄、生地、水蛭等中药集甘苦咸味于一体、攻补兼施,祛邪扶正,使肝和而能辨色视物[5]。有研究已证实芪明颗粒具有成本低,作用广泛的优势,相比西药而言既能改善DR又可延缓DN[6-7]。故本研究通过网络药理学探究芪明颗粒发挥“眼肾同治”作用的药效物质基础和潜在分子机制,为今后的相关性研究提供一定的参考价值。

1 资料与方法

1.1 芪明颗粒活性成分及其靶点的筛选获取通过TCMSP[8]数据库对芪明颗粒方中黄芪、葛根、枸杞子、决明子和蒲黄的活性成分及成分靶点进行查找汇总,以口服生物利用度≥30%且类药性指数≥0.18 为条件筛选出有效成分。通过TCMID[9]数据库检索获取茺蔚子、生地和水蛭的活性成分,并在PubChem[10]和SwissTargetPrediction[8]数据库中预测其对应的潜在成分靶点,最后导入UniProt[9]数据库规范靶点名称。

1.2 “芪明颗粒-活性成分-作用靶点”网络图的构建通过GeneCards[9]、DrugBank[9]、TTD[9]和OMIM[9]数据库整合DR和DN的疾病靶点基因,筛选去重并对其靶点名称进行标准化处理。借助Venny2.1在线分析平台构建韦恩图获取芪明颗粒成分靶点与疾病靶点的交集,通过Cytoscape 3.9.1软件中的插件绘制“芪明颗粒-活性成分-作用靶点”网络图,对其进行可视化分析。

1.3 PPI网络图及核心靶点-细胞组织网络图的构建借助STRING[9]平台中Multiple proteins工具对芪明颗粒作用靶点的蛋白质互作(PPI)进行网络分析,并导入Cytoscape 3.9.1软件对靶点基因进行拓扑分析,最终筛选度值大于 2 倍中位数的靶点作为核心靶点。通过BioGPS[11]数据库在线分析靶点基因在脏器组织和细胞中的表达,导入 Cytoscape 3.9.1软件绘制核心靶点-细胞组织网络图并进行网络数据分析。

1.4 基因本体分析和京都基因与基因组百科全书富集分析通过DAVID[12-13]数据库对获得的作用靶点进行基因本体(GO)分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析,其中GO富集包括生物过程、细胞组分和分子功能三个分支。导出分析结果以Excel文件保存,筛选表中P<0.01且FDR<0.01的结果,并将排名前20位的显著结果导入ImageGP在线绘图平台绘制气泡图进行可视化分析。

1.5 分子对接借助PubChem网站和PDB数据库[8]获取芪明颗粒8种主要药效成分和核心靶点蛋白激酶B(Akt)的PDB文件,分别通过Chem3D软件和PyMol软件进行格式优化。基于分子对接计算过程利用AutoDock Tools 1.5.7软件对所有药效成分进行质子化以及加电荷处理,并作为配体以ligand.pdbqt格式文件保存;对靶点Akt进行去溶剂化、质子化和加电荷处理,并作为受体以protein.pdbqt格式文件保存,设置参数并运行autogrid及 autodock程序,将最终结果导入PyMol[8]软件进行可视化处理。

2 结果

2.1 芪明颗粒的活性成分及其成分靶点分析在TCMSP和TCMID数据库中检索筛选共获得157个活性成分,其中黄芪20个,葛根4个,枸杞子45个,决明子14个,蒲黄8个,茺蔚子10个,生地34个,水蛭22个,汇总去重后得到146个活性成分。借助PubChem数据库和SwissTargetPrediction数据库筛选去重获得这些活性成分的预测成分靶点共972个,导入UniProt数据库规范其靶点名称。

2.2 芪明颗粒治疗DR、DN的作用靶点分析以DR和DN的英文疾病名为检索词在GeneCards、DrugBank、TTD和OMIM数据库中筛选得到DR和DN的靶点基因分别为4265个和12 137个,矫正去重后共得到4039个疾病靶点。借助Venny2.1网站中的分析工具得到芪明颗粒对DR、DN发挥治疗作用的靶点为465个。

2.3 “芪明颗粒-活性成分-作用靶点”网络分析借助Cytoscape 3.9.1软件构建“芪明颗粒-活性成分-作用靶点”网络并进行拓扑分析(图1)。网络中共有596个节点和2214条边,其中包括131个活性成分和465个交集靶点。经过拓扑分析发现,每个活性成分平均与16.9个靶点关联,而与每个靶点关联的活性成分平均为4.7个。其中自由度值和中心度值均排名前10位的活性成分分别为槲皮素、金色酰胺醇酯、刺槐素、α-亚麻酸、亚麻酸、阿魏酸甲酯、diincarvilone A、水蛭素、脱硫酸化肝素、酸橙素烯醇。

2.4 PPI网络及核心靶点分析将在STRING平台分析获得的PPI网络导入Cytoscape 3.9.1软件,利用拓扑分析得到464个节点和11 061条边(图2)。分析网络发现靶点的度值越大,节点便越大,其他靶点与该靶点的连线也越粗。最终筛选度值大于2倍中位数的靶点定义为核心靶点,其中排名前6位的靶点分别是3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)、Akt、肿瘤蛋白P53(TP53)、肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素6(IL6)、血管内皮生长因子A(VEGFA)。

图2 芪明颗粒与DR、DN交集靶点的PPI网络及核心靶蛋白

2.5 核心靶点-细胞组织网络图分析通过Cytoscape 3.9.1软件将BioGPS数据库在线分析得到的结果绘制核心靶点-细胞组织网络并进行拓扑分析(图3)。结果显示核心靶点主要在视网膜、肾脏、胰岛、平滑肌等组织中表达。

图3 核心靶点-细胞组织网络

2.6 GO 与 KEGG 富集分析将DAVID数据库中分析得到的GO和KEGG富集结果导出为Excel文件,并筛选表中P<0.01、FDR<0.01且排名前20位的显著结果,导入ImageGP在线绘图平台绘制气泡图(图4)。分析图中数据发现,在GO富集分析中,与生物过程相关的条目有1289个,主要包括对细胞增殖、迁移、凋亡、基因表达、磷脂酰肌醇3-激酶信号、Akt信号、MAPK级联、ERK1/2级联的调节,蛋白磷酸化,炎症反应,血管生成,低氧反应;与细胞组成相关的有155 个,主要有质膜及其整体成分、黏着斑、整个细胞及其外泌体、溶酶体,高分子配合物,受体复合物,神经元胞体等;分子功能涉及263个,主要有蛋白质丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶的活性及结合,转录因子的活性及结合,肽链内切酶活性,锌离子、整合素、血红素、受体等的结合。KEGG富集涉及的通路有202个,主要包括多种癌症途径、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/Akt信号通路、糖尿病并发症中的糖基化终末产物(AGEs)/AGEs受体(RAGE)信号通路、流体剪切力与动脉粥样硬化等。

图4 GO和KEGG富集分析图 A:生物过程;B:细胞组分;C:分子功能;D:KEGG。

2.7 分子对接验证结果为进一步探究芪明颗粒主要药效成分与核心靶点之间的能量及稳定性,运行AutoDock Tools 1.5.7软件中的多种程序对其进行分子对接,结果显示这些活性成分构象的结合自由能比较低,说明其构象趋于稳定(表1)。其中这些成分作为配体能够与Akt受体产生静电力和氢键等并相互作用(图5),对Akt的活化可能具有抑制作用,从而达到治疗DR和DN的效果。

表1 重要活性成分与核心靶点结合自由能

图5 重要活性成分与核心靶点Akt的分子对接模式 A:槲皮素与Akt;B:金色酰胺醇酯与Akt;C:刺槐素与Akt;D:α-亚麻酸与Akt;E:亚麻酸与Akt;F:阿魏酸甲酯与Akt;G:diincarvilone A与Akt;H:脱硫酸化肝素与Akt。

3 讨论

DR和DN的病理生理改变和发病机制极为相似,目前中医论治时常益气养阴通络。芪明颗粒为益气养阴、活血通络的经典复方,在防治气阴两虚型DR、DN时作用显著[6]。本研究利用网络药理学发现芪明颗粒发挥“眼肾同治”作用的活性成分繁多,多属于黄酮类、木脂素及酚酸类化合物。槲皮素和刺槐素是关键药效成分,有研究已证实了槲皮素不仅能够调控高糖引起的细胞凋亡,增强抗氧化酶活性以保护肾脏,而且还可调节DR的炎症反应和血管功能障碍[13-14]。此外,Bissim等[15]研究表明,金色酰胺醇酯具有抗炎、抗氧化和抗糖尿病的作用。

PPI 网络研究结果显示,GAPDH、Akt、TP53、TNF、IL6、VEGFA是芪明颗粒发挥治疗作用的核心靶点。GAPDH作为促凋亡分子在内质网应激诱导的视网膜Müller细胞凋亡以及高糖诱导的氧化应激中发挥了重要作用[16-17]。Akt是PI3K/Akt通路中调控糖脂代谢和维持细胞内环境稳定的关键酶[18]。TP53可通过与PI3K/Akt信号通路相互作用从而参与调控葡萄糖稳态,影响组织的代谢[19]。IL6和TNF-α在炎症反应引起的内皮功能障碍中发挥了关键作用,有研究显示,DR和DN出现血管渗漏和新生血管时二者均有参与[20]。VEGFA在高糖的刺激下能够与血管内皮细胞中VEGF受体1/2(VEGFR1/2)结合,不仅参与调控视网膜血管通透性、微炎症级联、血管生成等病理过程,而且在维持肾脏内皮细胞活性方面发挥着复杂作用[21-22]。本研究还通过BioGPS 数据库对芪明颗粒治疗DR、DN的核心靶点进行了细胞组织定位,分析发现芪明颗粒的确可作用于视网膜和肾脏的关键基因从而调控其蛋白活性以“眼肾同治”。

GO及KEGG富集分析发现,芪明颗粒发挥“眼肾同治”作用的生物学过程可能与细胞增殖迁移、炎症反应、血管生成、细胞凋亡及细胞因子介导的信号转导有关,且其可能通过调控PI3K/Akt信号通路、MAPK信号通路、糖尿病并发症中的AGEs/RAGE信号通路等多条通路治疗DR和DN。既往研究已证明PI3K/Akt信号通路和MAPK信号通路均是防治DR和DN的重要突破点,二者参与多种机制如氧化应激、神经炎症、新生血管、自噬等影响DR和DN的发生进展[23-24]。有研究表明,PI3K/Akt通路可通过参与调节细胞凋亡和葡萄糖代谢来影响细胞的增殖[18]。AGEs/RAGE信号通路可参与PI3K/Akt和MAPK的信号级联,在DN氧化应激、炎症反应和细胞凋亡等发病机制中以及DR的新生血管形成中占据了重要地位[25-26]。

综上所述,芪明颗粒可能通过槲皮素、刺槐素等主要药效成分作用于GAPDH、Akt等核心靶点,并调控PI3K/Akt信号通路、AGEs/RAGE信号通路等,发挥“眼肾同治”作用治疗DR和DN。分子对接结果进一步说明芪明颗粒可能抑制DR和DN核心靶点蛋白的活性,从而实现“眼肾同治”的合理性和科学性。本次网络药理学和分子对接研究结果与既往研究也较接近,可靠性和准确性比较好,不过还需结合临床研究和基础实验进一步验证芪明颗粒“眼肾同治”DR和DN的药理机制。