circRNA_0051079通过靶向miR-26a-5p/PTEN轴诱导视网膜神经变性的分子机制

李玉平 王伶俐 陈 震 宋 辉 姚为华 刘 易

缺血诱导的视网膜神经变性被证实与多种眼部疾病的发病机制有关,例如急性闭角型青光眼、视网膜血管阻塞和糖尿病视网膜病变[1-2]。然而现有的治疗方法尚不能达到修复或阻止视网膜神经变性的目的[3]。因此,深入阐述视网膜神经变性的潜在机制对于靶向药物的研发有重要意义。视网膜神经变性是一个复杂的病理过程,氧化应激、炎症反应、遗传/表观遗传变化等都在其中发挥着重要作用[4]。内源性环状RNA(circRNA)是由前mRNA的反向剪接产生的一类共价闭合环状转录物,虽然没有编码蛋白的能力,但却能产生涉及许多生物过程和人类疾病的非编码转录本[5]。越来越多的研究表明,circRNA失调与多种神经退行性疾病有关[5-6]。视网膜也被认为是胚胎发育过程中大脑的直接延伸,是中枢神经系统的一部分[7]。因此我们推测,circRNA可能在视网膜神经变性过程中发挥重要作用。circ_0051079是位于人chr19:40747844-40771258的circRNA,在人、小鼠和大鼠基因组中具有高度保守的同源基因。视网膜缺血性神经变性的一个重要原因是缺血/再灌注(I/R)损伤[8]。本研究观察了circ_0051079对视网膜神经节细胞(RGC)损伤和I/R诱导的视网膜神经变性的影响,并进一步揭示相关的分子机制。

1 材料与方法

1.1 细胞实验

1.1.1 小鼠RGC原代分离和培养从上海SLAC实验动物有限公司购买5只C57BL/6J孕鼠(14周龄,体重32～36 g),生产后取出生5 d的乳鼠8只,腹腔内注射戊巴比妥钠5 mg·kg-1麻醉后处死。立即在含HBSS培养基和HEPES的预冷解剖缓冲液中摘出眼球,分离出视网膜。用5 g·L-1木瓜蛋白酶消化视网膜0.5 h,用抗巨噬细胞血清(1100;美国Accurate Chemical公司)孵育1 h以清除巨噬细胞和小胶质细胞。将未贴壁的细胞转移到预先偶联抗Thy1.2抗体(120稀释,美国Bio-Rad)的培养皿中,室温下纯化RGC 1 h。将原代RGC培养在含胰岛素(2.0 mmol·L-1)、孕酮(40 nmol·L-1)、亚硒酸盐(60 nmol·L-1)、转铁蛋白(100 nmol·L-1)、亲胆碱能神经元因子(CNTF;40 μg·L-1)和佛司可林(6 μmol·L-1)的DMEM培养基中。本研究所有动物实验均按照《实验动物护理和使用指南》进行,并经黄冈市中心医院医学伦理委员会批准。

1.1.2 细胞分组及转染将RGC随机分为对照组、siRNA组、si_circ_0051079组、模拟物对照组、miR-26a-5p组、miR-26a-5p+vector组、miR-26a-5p+PTEN组。RGC以每孔1×105个接种在6孔板上培养过夜。当细胞融合达到80%时,将si-circ-0051079和阴性对照siRNA的小干扰RNA[由GenePharma(中国上海)合成]使用 Lipo3000TM(美国invitrogen公司)分别转染至si_circ_0051079组和siRNA组RGC中。模拟物对照组、miR-26a-5p组、miR-26a-5p+vector组和miR-26a-5p+PTEN组分别将Scr mimic、miR-26a-5p mimic、pcDNA 3.1(vector)和miR-26a-5p+PTEN通过Lipo3000TM转染至对应的RGC中。转染过程中,miRNA模拟物和siRNA的浓度为50 nmol·L-1,质粒浓度为4.0 g·L-1。正常培养条件为37 ℃和体积分数5% CO2,缺氧诱导条件为37 ℃和体积分数1% O2、体积分数5% CO2、体积分数94% N2,培养24 h。氧化应激诱导时,需要加入H2O2(50 μmol·L-1)培养24 h。

1.1.3 RT-qPCR检测使用TRIzol试剂提取各组细胞总RNA。使用SuperScript III第一链合成试剂盒(美国Invitrogen公司)反向转录总RNA。逆转录:37 ℃ 60 min,95 ℃ 5 min,维持在4 ℃。随后,使用PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix(美国Applied Biosystems)和特异性基因引物序列在PikoReal 96 PCR仪(美国Thermo Fisher Scientific)中进行反应。反应条件为:95 ℃初始变性3 min,然后95 ℃ 10 s、56 ℃ 30 s和72 ℃ 60 s,42个循环。以GAPDH 基因作为内参,反应后采用2-△△Ct法计算circ_0051079、miR-26a-5p和PTEN的相对表达量。

1.1.4 CCK-8检测细胞活性将RGC以每孔5×103个接种到96孔板中。在转染和缺氧或氧化应激诱导后,将RGC与每孔中的20 μL CCK-8溶液在 37 ℃ 下孵育3 h。加入CCK-8试剂,用酶标仪在450 nm波长处检测吸光度。

1.1.5 TUNEL染色法检测RGC凋亡各组RGC在4 ℃下用40 g·L-1多聚甲醛固定30 min,并在室温下用封闭缓冲液(H2O2和CH3OH)封闭15 min。体积分数0.1% Triton X-100在冰浴中孵育10 min,TUNEL反应混合物孵育1 h,室温下DAPI染色5 min以标记细胞核。使用Olympus IX-73荧光显微镜在6个随机视野中观察染色信号。

1.1.6 荧光素酶报告基因测定将circ_0051079序列插入pGL3载体的Kpn I和Hind III位点,构建Luc-circ_0051079载体。使用circRNA Interactome数据库(https://circinteractome.nia.nih.gov/)预测circ_0051079相互作用的miRNA。将RGC以每孔5×103个接种在96孔板中。培养24 h后,分为模拟物对照组和miR-26a-5p组,使用 Lipo3000TM转染后进一步与荧光素酶报告载体共转染(含有circ_0051079/PTEN 野生型或突变型 3’UTR),使用荧光素酶报告分析系统(美国Promega)测定荧光素酶活性。表达 pRL-TK的载体海肾荧光素酶用作转染的内部对照。空载体pGL3-basic用作阴性对照。

1.1.7 RNA免疫沉淀实验用RNA免疫沉淀(RIP)裂解缓冲液裂解RGC,并将细胞裂解物与抗AgO2或抗IgG抗体缀合的磁珠在4 ℃下孵育8 h。将磁珠与蛋白酶K在58 ℃下孵育30 min以去除蛋白。用TRIzol试剂提取免疫沉淀的RNA,并进行RT-qPCR以确定circ_0051079的表达水平。

1.2 动物在体实验

1.2.1 动物35只雄性C57BL/6小鼠(8周龄,体重25～30 g),由上海SLAC实验动物有限公司提供。饲养环境:恒温(23±2)℃,相对湿度50%±10%,12 h光照/黑暗周期循环,自由取食和饮水。

1.2.2 视网膜I/R损伤模型建模方法参考Wang等[9]的研究,取15只雄性C57BL/6小鼠腹腔注射氯胺酮(80 mg·kg-1)和赛拉嗪(4 mg·kg-1)麻醉。用5 g·L-1去氧肾上腺素和5 g·L-1托吡卡胺散瞳。涂抹盐酸奥布卡因凝胶,用一根30号针头插入小鼠左眼前房,该针头与位于眼上方120 cm的盐水袋相连,使眼压升高至90 mmHg(1 kPa=7.5 mmHg)。前房拔针1 h后,眼压恢复正常。对侧眼与盐水袋相连,盐水袋不高于眼,保持正常的眼压作为对照。1 h 后将针从眼中取出。I/R损伤模型建立成功后,在0 d、3 d和7 d各随机选取5只小鼠收集视网膜检测circ_0051079表达量。

1.2.3 小鼠分组及处理将20只雄性C57BL/6小鼠随机分为4组,每组5只,其中,(1)正常对照组:针头插入左眼前房但不升高眼压,另一眼未处理;(2)I/R组:左眼制作I/R损伤模型,另一眼未处理;(3)I/R+对照shRNA组:左眼注射1.0 μL Scr shRNA并制作I/R损伤模型,另一眼未处理;(4)I/R+circ_0051079 shRNA组:左眼注射1.0 μL circ_0051079 shRNA并制作I/R损伤模型,另一眼未处理。I/R+circ_0051079 shRNA组和I/R+对照shRNA组小鼠制作I/R损伤模型前14 d左眼玻璃体内分别注射1.0 μL 7.5×10-5mg·L-1的circ_0051079 shRNA或等量Scr shRNA。在RNA聚合酶III启动子U6的控制下,将shRNA插入AAV-2载体,然后用pHelper和pAAV-RC包装得到重组的AAV2-circ_0051079 shRNA或AAV2-Scr shRNA。I/R损伤后7 d,各组小鼠均置于体积分数100% CO2容器中主动暴露2 min后,再进行3 min 的被动暴露,实施安乐死。

1.2.4 HE染色摘取实施安乐死后4组所有小鼠双侧眼球,分离出视网膜组织,4 ℃于40 g·L-1多聚甲醛中固定,石蜡包埋。垂直于视盘切片(厚度为5 μm)。将组织切片用二甲苯脱蜡并在梯度乙醇中再水化。用ddH2O冲洗后,苏木素室温染色5 min,伊红室温染色45 s,中性树脂室温封固,光学显微镜下观察视网膜形态。

1.2.5 蛋白免疫荧光染色将视网膜切片用50 g·L-1牛血清白蛋白在37 ℃下封闭30 min,与抗胶质纤维酸性蛋白(GFAP;1200,英国Abcam)抗体、神经元特异性核蛋白(NeuN;1300,英国Abcam)抗体或微管蛋白抗体β3(TUJ1;1300,英国Abcam)在4 ℃下孵育过夜。然后与Alexa Fluor 594二抗(1500,英国Abcam)在4 ℃下孵育4 h。细胞核在室温下用DAPI标记15 min。使用Olympus IX-73荧光显微镜在6个选定的视野中观察染色信号。

1.3 临床试验房水样本于2020年11月至2021年3月从黄冈市中心医院眼科获得,并获得了所有患者的书面知情同意书。青光眼患者房水样本(n=20)取自急性闭角型青光眼且不合并白内障的患者(男12例,女8例;年龄53～66岁),对照患者房水样本(n=20)取自白内障且不合并急性闭角型青光眼的患者(男11例,女9例;年龄50～63岁),2组患者均未合并其他基础性疾病。如果患者有其他眼科或全身性疾病,或接受过全身和局部类固醇治疗青光眼,或接受过眼科手术或玻璃体内注射抗VEGF药物,则被排除在外。使用RT-qPCR法测定2组患者房水样本中circ_0051079、miR-26a-3p、PTEN mRNA表达水平。

1.4 统计分析使用GraphPad Prism 5分析所有数据。实验独立重复3次,数据以平均值±标准差表示。使用配对样本t检验或独立样本t检验进行两个样本之间的比较,采用单因素方差分析和Bonferroni检验进行多重比较。检验水准:α=0.05。

2 结果

2.1 细胞实验结果

2.1.1 体外I/R损伤诱导的RGC中circ_0051079表达变化与对照组RGC相比,在缺氧(体积分数1%O2暴露24 h)或氧化应激(50 μmol·L-1H2O2暴露24 h)条件下培养,RGC中circ_0051079表达水平分别增加了(3.56±0.43)倍和(2.83±0.37)倍(均为P<0.05)。

2.1.2 沉默circ_0051079可减轻缺氧或氧化应激诱导的RGC损伤RT-qPCR检测结果显示,与对照组(1.00±0.07)相比,siRNA组RGC中circ_0051079表达量(0.97±0.08)变化不大(P>0.05),而si_circ_0051079组RGC中circ_0051079表达量(0.27±0.02)显著降低(P<0.05)。CCK-8检测和TUNEL染色结果显示,在正常条件、缺氧条件、氧化应激条件下培养的RGC细胞活力分别为(100.0±2.34)%、(48.1±3.61)%、(42.60±3.29)%,凋亡细胞数分别为(2±2)个、(17±3)个、(11±2)个,与正常条件下培养的RGC相比,缺氧或氧化应激条件下培养的RGC细胞活力均降低,凋亡细胞数均增加,差异均有统计学意义(均为P<0.05);在缺氧或氧化应激条件下,si_circ_0051079组RGC细胞活力分别为(73.4±2.99)%和(70.91±3.08)%,凋亡细胞数分别为(5±1)个和(4±2)个,siRNA组RGC细胞活力分别为(49.17±3.30)%和(47.65±4.31)%,凋亡细胞数分别为(18±3)个和(11±2)个,2组相比差异均有统计学意义(均为P<0.05)(图1)。

图1 TUNEL染色分析RGC细胞凋亡情况 A:缺氧条件(体积分数1%O2暴露24 h);B:氧化应激条件(50 μmol·L-1H2O2暴露24 h)

2.1.3 circ_0051079对miR-26a-5p的海绵吸附作用生物信息学分析预测结果显示,circ_0051079是miR-26a-5p的潜在海绵(图2A)。RIP实验结果显示,与IgG抗体比较,Ago2抗体可以免疫沉淀circ_0051079(图2B)。荧光素酶报告基因分析结果显示,对于miR-26a-5p mimics组细胞,与突变型circ_0051079共转染相比,miR-26a-5p显著降低野生型circ_0051079的荧光素酶活性(图2C)。同样,生物信息学分析结果也显示,miR-26a-5p和PTEN之间具有结合位点(图2D)。对于miR-26a-5p mimics组RGC,与突变型PTEN 3’UTR共转染相比,miR-26a-5p显著抑制野生型PTEN 3’UTR的荧光素酶活性(图2E)。

图2 circ_0051079与miR-26a-5p靶向关系 A:circ_0051079和miR-26a-3p的靶向序列;B:miR-26a-3p和PTEN mRNA的靶向序列;C:使用Ago2或IgG抗体进行RIP实验结果;D:circ_0051079和miR-26a-3p的靶向作用;E:miR-26a-3p和PTEN 3’UTR的靶向作用。*P<0.001。

2.1.4 miR-26a-5p/PTEN轴对RGC细胞活力的影响RT-qPCR检查结果显示,对照组RGC中miR-26a-5p、PTEN表达量分别为1.01±0.06、0.98±0.07;与对照组相比,miR-26a-5p组RGC中miR-26a-5p表达量(3.21±0.14)增加,但PTEN表达量(0.65±0.04)降低(均为P<0.05)。CCK-8检测结果显示,缺氧诱导后,与对照组相比,miR-26a-5p组和miR-26a-5p+vector组RGC细胞活力分别增加至(5.12±0.31)倍和(4.98±0.36)倍(均为P<0.05),但2组间比较差异无统计学意义(P>0.05);此外miR-26a-5p+PTEN组RGC细胞活力增加至(1.97±0.20)倍,低于miR-26a-5p+vector组(P<0.05)。

2.2 动物在体实验结果

2.2.1 I/R损伤小鼠视网膜中circ_0051079表达变化与对侧正常眼小鼠视网膜中circ_0051079表达量(1.00±0.03)相比,I/R损伤后0 d时,小鼠视网膜中circ_0051079表达量(1.05±0.06)基本无变化(P>0.05);I/R损伤后3 d、7 d时,损伤眼的视网膜组织中circ_0051079表达量(1.87±0.11、3.02±0.17)均高于对侧正常眼(均为P<0.05)。

2.2.2 沉默circ_0051079对I/R损伤小鼠视网膜的影响与正常对照组小鼠视网膜中circ_0051079表达(1.00±0.07)相比,I/R+circ_0051079 shRNA组小鼠视网膜中circ_0051079表达(0.37±0.04)降低(P<0.05)。与正常对照组相比,I/R组和I/R+对照shRNA组小鼠视网膜厚度均显著减少,TUJ1和NeuN染色减少,GFAP染色增加;与I/R+对照shRNA组相比,I/R+circ_0051079 shRNA组可以部分逆转I/R损伤诱导的视网膜厚度减少,并减少I/R诱导的神经节细胞层(GCL)神经变性(图3A),进一步导致GFAP染色减少(图3B)以及TUJ1(图3C)和NeuN(图3D)染色增加。

图3 各组小鼠I/R诱导的视网膜损伤情况 A:HE染色;B:TUJ1荧光染色;C:GFAP荧光染色;D:NeuN荧光染色;E:各组TUJ1、GFAP、NeuN相对荧光量变化。1:正常对照组;2:I/R组;3:I/R+对照shRNA组;4:I/R+circ-0051079 shRNA组。IPL:内丛状层;INL:内核层;OPL:外丛状层;ONL:外核层;RPE:视网膜色素上皮。*P<0.001。

2.3 临床患者中circ_0051079、miR-26a-3p、PTEN mRNA 表达与白内障患者房水样本中circ_0051079(1.01±0.07)、miR-26a-5p(1.00±0.06)、PTEN mRNA(0.99±0.05)表达相比,青光眼患者房水样本中circ_0051079(2.65±0.18)和PTEN mRNA(1.78±0.14)表达均显著升高(均为P<0.001),miR-26a-5p表达(0.54±0.11)显著下调(P<0.001)。

3 讨论

视网膜缺血是视力障碍的主要原因,也是多种眼部疾病的常见病理基础[1-2]。预防I/R损伤可以减缓视网膜神经变性的发展[9-10]。本研究结果表明,沉默circ_0051079可以减少体内视网膜反应性神经胶质增生并减少RGC损伤。敲除circ_0051079还可以缓解缺氧应激和氧化应激诱导的RGC损伤。本研究提供了一种新的circRNA介导的视网膜缺血性疾病机制。

视网膜I/R损伤涉及广泛的病理机制,如视网膜神经变性和视网膜血管功能障碍[1-3]。既往研究表明,这一过程受到复杂的调控网络的调控,包括编码RNA和非编码RNA[7]。circRNA是一类通过反向剪接产生的新型内源性非编码RNA,已成为基因表达的新调节因子[5]。目前,circRNAs已成为用于诊断和评估疾病进展和预后的常用生物标志物[10-11]。高通量测序和共表达网络分析显示[12],circXPO5的表达与GRIN2A mRNA相关,沉默CircXPO5可能通过调节GRIN2A在青光眼患者中枢视神经元的凋亡中发挥神经保护功能。Jiang等[13]研究发现,circRNA-ZNF532在糖尿病黄斑水肿、增生型糖尿病视网膜病变和糖尿病性虹膜新生血管患者的玻璃体中表达上调,其表达与糖尿病视网膜病变的严重程度相关,同时过表达circRNA-ZNF532可防止糖尿病诱导的视网膜周细胞变性和血管功能障碍。本研究结果表明,circ_0051079在体内和体外视网膜神经变性过程中均显著上调。急性闭角型青光眼是一种I/R相关眼部疾病[2],在本研究中,与白内障对照患者相比,青光眼患者房水样本中circ_0051079表达水平显著上调。circ_0051079介导的miR-26a-3p/PTEN信号在I/R相关眼部疾病中也存在失调。因此,circ_0051079被认为是视网膜I/R相关疾病诊断和预后可能的生物标志物。

I/R 相关的视网膜疾病是全球视力障碍的主要原因,目前尚无有效的治疗方法[2]。氧化应激和缺氧应激是视网膜I/R期间疾病进展和RGC损伤的关键驱动因素[2,14]。I/R损伤可导致活性氧产生、炎症反应和视网膜损伤,包括血管损伤和神经变性[15]。视网膜神经元,特别是RGC,对视网膜缺血高度敏感[16]。为了了解疾病病理变化并研究可能的神经保护方法,需要可靠的研究模型。本研究我们建立了C57BL/6J小鼠RGC的离体变性模型,通过在培养基中添加体积分数1% O2或50 μmol·L-1H2O2,导致缺氧或氧化应激诱导的视网膜损伤,转染后发现,沉默circ_0051079可以保护RGC在体外免受相关损伤。此外,在体内,circ_0051079的敲低可以减轻I/R损伤引起的视网膜神经变性。因此,circ_0051079沉默可能是治疗I/R相关眼部疾病的可行的神经保护策略。既往研究表明,由外显子产生的circRNA通常存在于细胞质中,并可能充当miRNA海绵,与线性mRNA竞争或调节其亲本基因的转录来发挥作用[17-18]。本研究结果表明,circ_0051079可以与miR-26a-5p结合并通过充当miRNA海绵来调节RGC功能。值得注意的是,PTEN被证实为miR-26a-5p的靶基因[19];据报道,PTEN作为细胞凋亡的介质并在神经元中发挥重要作用[20]。在海马神经元中,通过减少活性氧的产生,进而减少细胞色素C的释放、减少caspase-9的激活,PTEN的下调被证明可以显著保护海马细胞免受星形孢菌素诱导的凋亡[21]。PTEN通常位于细胞质溶胶中,可被募集到细胞膜的特定微结构域,并有助于乳胞素诱导的神经元凋亡的发展[22]。此外,Mak等[23]也证实,PTEN基因缺失可引起视神经损伤后视神经中的部分轴突再生,并改善RGC树突萎缩。荧光素酶报告基因分析和RIP实验检测结果表明,circ_0051079可以通过调节miR-26a-3p/PTEN信号转导进而影响RGC功能。此外,细胞实验结果显示,miR-26a-5p+PTEN组RGC细胞活力显著增加;并且在临床研究中,青光眼患者房水中circ_0051079和PTEN mRNA表达显著增加,miR-26a-3p表达降低。因此,circ_0051079可以作为miR-26a-5p海绵,从而释放miR-26a-5p对PTEN的抑制作用。这种调节机制可以为RGC损伤和I/R诱导的视网膜神经变性性疾病提供新的思路。

总之,本研究探讨了circ_0051079的表达模式及其在I/R诱导的视网膜神经变性中的相关机制。结果显示,circ_0051079在体内和体外视网膜神经变性中增加。相比之下,circ_0051079的沉默可以防止I/R诱导的 RGC损伤并减轻I/R诱导的视网膜神经变性。本研究为视网膜I/R损伤的机制提供了一个新的研究视角,并为治疗I/R相关眼部疾病提供了一个潜在的靶点。