滇中地区核桃枝枯病病原菌与主栽品种抗病性的鉴定

姬靖捷,陈健鑫,魏玉倩,刘乐荷,伍建榕,2*,马晓庆,朱继芬

(1.西南林业大学 国家林业局西南地区生物多样性保育重点实验室,云南 昆明 650224;2.西南林业大学 云南省高校森林灾害预警控制重点实验室,云南 昆明 650224;3.云南省昆明市嵩明县林业与草原局,云南 嵩明 651700)

0 引言

【研究意义】核桃(Juglansregia)又称胡桃,种仁含油量高,为木本油料之王,营养丰富。中国核桃品种多样,资源丰富,是当今世界第一大核桃生产国[1]。当前,核桃种植业在滇中地区已具相当规模,昆明禄劝、玉溪及楚雄等地核桃产业经济日渐壮大。核桃枝枯病在我国各大核桃产区均有发生,严重时落果率达60%以上,甚至绝收,造成核桃大面积减产,给果农带来巨大的经济损失[2]。因此,开展核桃枝枯病病原鉴定并提出相应防治措施对保障核桃产业健康发展具有十分重要的意义。【前人研究进展】核桃枝枯病主要危害核桃枝干,随着核桃大量纯林种植,该病呈大面积发生趋势。LI等[3]对河南、北京和四川的核桃枝干病害进行研究发现,葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)和假可可毛色二孢(Lasiodiplodiapseudotheobromae)是引起当地核桃枝干病害的病原菌,且核桃是假可可毛色二孢的新纪录寄主。尹万瑞[4]对四川核桃主产区核桃枝枯病病原进行探究发现,其病原菌为新壳梭孢(Neofusicoccumparvum),并在此基础上筛选出70%甲基托布津、50%多菌灵和75%百菌清对核桃枝枯病菌有明显的抑制作用,其中,以甲基托布津的EC50最小,为4.521 4 μg/mL,表明药剂抑制最好;其次为多菌灵和百菌清,其EC50分别为4.624 0 μg/mL和7.193 0 μg/mL。KARACA等[5]对土耳其核桃枝枯病研究发现,茶褐斑拟盘多毛孢菌(Pestalotiopsisguepinii)是引起该地核桃枝枯病的病原。TROUILLAS等[6]在2009—2010年对加利福尼亚的核桃枝干枯梢病病原菌进行研究,首次报道引起该地区核桃枝干枯梢病的病原菌为Neofusicoccummediterraneum。【研究切入点】从已有的报道看出,各地引起核桃枝枯病的病原存在差异,关于滇中核桃产区引起核桃枝枯病病原菌的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】采用组织分离、柯赫氏试验与形态学鉴定、分子生物学鉴定相结合的方法,对采自滇中核桃产区的核桃枝枯病标本进行病原菌分离培养和鉴定,并通过菌饼刺伤接种活体枝条的方法研究滇中地区7个核桃主栽品种(漾濞核桃、三台核桃及云新高原等)对致病菌株的抗性,以探明滇中地区核桃枝枯病的病原菌种类,为抗性主栽核桃品种选育及核桃枝枯病防治提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病样 2015年,对滇中地区嵩明县牛栏江镇滇中玉麒麟核桃种植园、保山市昌宁县、楚雄州的大姚县和漾濞彝族自治县各大核桃产区进行核桃枝枯病病害调查,采集受害枝条进行拍照和症状描述,带回实验室。

1.1.2 核桃枝条 7个云南核桃主栽品种漾濞核桃、漾江1号、云新云林、云新高原、三台核桃、昌宁细香核桃及新疆核桃的2年生健康植株嫩枝,长15 cm。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分离培养 采用常规PDA培养基和组织分离法进行病原菌的分离和纯化,对纯化后的菌株进行形态观察及分子鉴定[7]。

1.2.2 致病性测定 采集健康的核桃枝条,无菌水培养,针刺枝条皮部造成伤口,将菌饼接种在针刺部位,以无菌培养基菌饼接种在伤口作为对照(CK),连续观察7 d,记录枝条的发病状况。

1.2.3 病原菌鉴定

1) 形态学鉴定。对病症明显的受害枝条徒手切片,在显微镜下观察病原菌在寄主组织中的形态;挑取纯培养的菌株,观察其菌丝及孢子形态,并进行显微拍照[7-9]。

2) 分子生物学鉴定。采用Forensic DNA Kit试剂盒提取纯培养菌株的DNA,于-20℃保存。以真菌总DNA为模板,采用真菌通用引物对ITS1/ITS4进行PCR扩增,PCR总反应体系为50 μL,其中,2×Power Taq PCR Master Mix 25 μL,ddH2O 20 μL,上下游引物各1.5 μL,DNA 2 μL。反应条件为94℃预变性3 min;94℃变性30 s,58℃退火40 s,72℃延伸50 s,40个循环;72℃下保持10 min,最后在PCR仪中4℃保存[10]。PCR产物委托昆明擎科生物有限公司测序,测序结果在NCBI上用BLAST搜索同源序列。下载部分同源性较高的序列和参考序列,通过MEGA 6.0利用邻接法(NJ)构建系统发育树。

1.2.4 核桃主栽品种的抗病性鉴定 采用菌饼刺伤接种活体枝条方法对7个核桃主栽品种进行抗病性测定。选择致病性最强的菌株作为代表菌株,从其培养7 d后的菌落上打取直径6 mm的菌饼,分别接种到7个主栽品种供试枝条被针刺的部位,1个枝条接种3个菌饼,每个处理接种3个枝条,3次重复,将接种好菌饼的枝条放到培养皿中置于培养箱(28℃,90% RH)中离体培养,3 d后去掉菌饼,分别在接种后3 d、5 d和7 d观察核桃枝条的发病情况并测量病斑直径。

1.3 数据统计与分析

采用Excel 2010和SPSS 17.0对数据进行统计与分析。

2 结果与分析

2.1 核桃枝枯病危害症状

大田调查发现,核桃枝枯病主要危害枝条,尤其以1～2年生嫩枝受害重,也可危害叶片和果实。枝条,发病初期病原菌先从顶梢嫩枝侵入,病枝皮层褪绿,然后呈浅红褐色,病部稍凹陷;后期病害向下蔓延至枝条和主干,受害处病斑发黑,扩散至绕枝条一周,且在病部表皮下产生许多突起的小粒点,即为病原菌的分生孢子器(图1)。叶片受害时在叶面形成黑褐色病斑,果实受害时则在青皮表面出现黑色斑块,后病斑逐渐扩大、下陷,致果实坏死早落。

注:A,自然条件下发病症状;B,人工接种发病初期;C,人工接种发病后期。Note:A,disease symptom of walnut branch rot under natural condition;B,early disease stage of walnut branch rot under artificial inoculation condition;C,later disease stage of walnut branch rot under artificial inoculation condition.图 1 核桃枝枯病危害症状Fig.1 Hazard symptoms of walnut branch rot

2.2 病原菌鉴定

2.2.1 形态学 通过组织分离和纯化培养,从病部纯化分离得到菌株DZHT113。形态观察发现,从受害枝条病症明显部位的徒手切片上可见分生孢子器呈圆球形,具孔口,器外壁光滑或有菌丝附着,分生孢子球形和线形(图2)。该病原菌在PDA培养基上培养7 d后,菌落呈近圆形,轮纹状且轮纹处略有隆起,菌丝白色,棉絮状。后期菌落变为深褐色,背面黑褐色。菌落平均直径为5.6～6.1 cm;分生孢子橄榄球形,无隔,多数具2个油球,大小为(4.8～6.7)μm×(2.3～2.9)μm;NaOH颜色反应呈黄绿色(图3)。根据以上形态特征,初步确定该病原菌为菜豆拟茎点霉(Phomopsisphaseoli)。

注:A,分生孢子器;B,分生孢子器和分生孢子;C,分生孢子。Note:A,pycnidium;B,pycnidium and conidium;C,conidium.图2 染病部位病原菌徒手切片 Fig.2 Transverse section of pathogenic fungus on the infected part

注:A,菌落;B,分生孢子两型孢子;C,分生孢子。Note:A,colony;B,dimnorphic conidium;C,conidium.图3 菌株DZHT113的形态特征Fig.3 Morphological characteristics of strain DZHT113

2.2.2 分子生物学鉴定 从图4看出,对菌株DZHT113的DNA进行PCR扩增,其ITS基因片段长度为750 bp。利用NCBI的BLAST进行同源序列比对,结果表明,核桃枝枯病病原菌的ITS序列与Phomopsissp.(GenBank登录号:KY797680)的同源性最高,达100%。在构建的系统发育树上,菌株DZHT113与MW968601.、MT043770聚为一支,结合形态学特征,确定该病原菌为菜豆拟茎点霉(Phomopsisphaseoli)。

图4 菌株DZHT113扩增的ITS基因片段(A)及其系统发育树(B)Fig.4 ITS gene (A) and phylogenetic tree (B) after the amplification of strain DZHT113

2.3 病原真菌的致病性

将分离所得目的菌株DZHT113的菌饼接种在核桃枝条被针刺的部位,培养7 d后,发病症状与田间自然条件下较一致,感病初期,幼嫩枝条出现红褐色或紫褐色病斑,后颜色逐渐变深,随着皮部枯死,病部密生颗粒状突起物,为病原菌的子座及分生孢子器。但人工接种的核桃嫩枝病部颜色较深,可见黑色颗粒状物(图5),空白对照的枝干未表现症状。将人工接种的核桃嫩枝病部再分离,得到的病菌与原病菌进行对比发现,二者形态特征相同。根据柯赫式法则,确定菌株DZHT113为引起核桃枝枯病的病原菌。

注:A,人工接种发病初期;B,人工接种未发病;C,人工接种发病后期。Note:A,early disease stage of walnut branch rot under artificial inoculation condition;B,no disease symptom of walnut branch rot under artificial inoculation condition;C,later disease stage of walnut branch rot under artificial inoculation condition.图5 菌株DZHT113的致病性Fig.5 Pathogenicity of strain DZHT113

2.4 核桃主栽品种对菜豆拟茎点霉的抗病性

调查发现,菌株DZHT113接种到健康枝条上7 d后,7个核桃主栽品种上病斑直径为1.23～87.00 mm,漾濞核桃的病斑直径最小,漾江1号和云新高原其次,病斑直径分别为2.21 mm和2.34 mm,三者与云新云林均显著小于三台核桃、昌宁细香核桃及新疆核桃的病斑直径;昌宁细香核桃病斑直径最大,显著高于除新疆核桃外的其余品种。表明,漾濞核桃、漾江1号、云新云林和云新高原对菌株DZHT113相对抗病,在接种初期病斑直径为2～5 mm,接种7 d后病斑呈黄色至棕黄色木质化表层;病健交界处有明显界限,病斑拓展很慢或不再拓展。三台核桃、昌宁细香核桃及新疆核桃相对感病,在相同条件下接种3 d后的病斑直径就达10～25 mm,接种7 d后病斑直径达95 mm以上,病斑拓展速度较快,颜色呈褐色至棕黑色,病健交界处无明显的界限,呈腐烂状。

3 讨论

目前,国内外对于核桃枝枯病的研究多针对矩圆黑盘孢菌(Melanconiumoblongum) 所致的枝枯病[11],拟茎点霉属(Phomopsis)真菌引起的核桃枝枯病在世界上许多国家发生,并有相关报道[12-13]。刘静等[14]报道,山东地区核桃枝枯病由Diaporthenobilis引发,其病原菌无性阶段为拟茎点霉属(Phomopsis);孙俊[15]研究表明,辽宁地区核桃枝枯病由胡桃楸拟茎点霉(Phomopsisjuglandina)引起。在云南地区,P.juglandina引起的核桃枝枯病仅在昆明曾有报道[16]。笔者在滇中地区林业有害生物普查中发现此病害,调查发现,核桃受害枝条发病初期病枝皮层退绿,然后呈浅红褐色,病部稍凹陷;后期病害向下蔓延至枝条和主干,受害处病斑发黑,扩散至绕枝条一周,且在病部表皮下产生许多突起的小粒点。形态学鉴定其分生孢子器呈圆球形,具孔口,器外壁光滑或有菌丝附着,分生孢子橄榄球形,无隔,多数具2个油球,大小为(4.8～6.7) μm×(2.3～2.9) μm。病原菌在PDA培养基上培养7 d后,菌落呈近圆形,轮纹状且轮纹处略有隆起,菌丝白色,棉絮状;后期菌落变为深褐色;菌落背面黑褐色。结合rDNA-ITS序列分析确定滇中地区核桃枝枯病病菌为菜豆拟茎点霉(Phomopsisphaseoli)。

在多次重复回接过程中发现,拟茎点霉对核桃嫩枝的侵染力较强,由此认为,病原菌极易通过伤口侵染核桃新枝,而且在温暖潮湿的环境中病菌极易侵染和传播。嫩枝接种后发病症状与成株期核桃树枝条自然条件下发病症状有所差别,可能与枝条的木质化程度、皮层厚度及生长势等的差异有关。

4 结论

经分离、纯化培养,从病样中成功分离得到致病菌株DZHT113,通过形态学与分子生物学鉴定该病原菌为菜豆拟茎点霉(Phomopsisphaseoli)。不同核桃品种对菌株DZHT113的敏感性差异显著,其中漾濞核桃、漾江1号、云新云林和云新高原表现相对抗病,三台核桃、昌宁细香核桃及新疆核桃表现相对感病。对于相对感病的品种应加强栽培管理,做好病害的预防工作,也可通过科学的种植方法将抗感品种搭配种植,以达到防治病害的目的。