抗菌肽和植物精油体外抑菌效果研究

■ 王凯 沈娟娟 阮鹏飞

（1 江门市澳保生物科技有限公司；2 江门市动物疫病预防控制中心）

我国是水产养殖大国，随着集约化养殖，水产动物疾病呈多发、复杂状态，生存环境恶化。由于预防并治疗鱼病等原因，人为在饲料中添加大量抗生素，这种方式带来了一系列问题，比如药物残留、耐药性及其毒副作用等，这些问题严重危害着水产品安全与人类健康。针对这一现状，在水产养殖过程中使用替抗产品迫在眉睫。

抗菌肽（Antimicrobial peptide；AMP）是一类两亲性阳离子型短肽，长度约为10～100个氨基酸残基。作为先天性免疫防御系统的重要组成部分，抗菌肽是自然界在长期进化过程中形成的一类天然抗病活性多肽因子，在所有生物防御外源病原微生物的第一道防线中起着不可或缺的重要作用。

植物精油属于天然、绿色、无残留物质，具有来源广泛、抗菌谱广、作用迅速、不易产生耐药性等特点。牛至油已被我国农业部批准作为一种可长期添加的药物饲料添加剂，从而说明天然植物提取物有望替代抗生物，具有较大的市场潜力。本研究针对从市场上收集的抗菌肽样品和植物精油样品进行体外抑菌实验，比较所有样品对水产常见致病菌大肠杆菌、副溶血弧菌、 嗜水气单胞菌、迟钝爱德华氏菌、鰤鱼诺卡氏菌、无乳链球菌、维氏气单胞菌等的抑菌效果对比，从而筛选出有显著抑菌作用效果的抗菌肽和植物精油产品，为实际养殖提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

表2 不同抗菌肽产品和植物精油产品对致病菌的最小抑菌浓度

1.1.1 指示菌株

大肠杆菌（Escherichiacoli）、副溶血弧菌（Vibrio Parahemolyticus）、 嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）、迟钝爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）、鰤鱼诺卡氏菌（Nocardia seriolae） 、 无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）、维氏气单胞菌（Aeromonas veronii），以上菌种均由江门市澳保生物科技有限公司菌种保藏中心提供。

1.1.2 抗菌肽和植物精油

10 个不同厂家生产的抗菌肽（Antimicrobial peptide, AP）和植物精油产品均为市售产品，由江门市澳保生物科技有限公司收集。10个抗菌肽产品分别标记为AP-1、AP-2、A P-3、A P-4、A P-5、A P-6、AP-7、AP-8、AP-9、AP-10，植物精油产品分别为桉叶素、香芹酚、肉桂醛、百里香酚。

1.1.3 培养基

TCBS培养基购自北京陆桥技术股份有限公司；大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）、脑心浸出液肉汤（BHI）、营养琼脂培养基、营养肉汤培养基，购自广东环凯微生物科技有限公司。

1.1.4 仪器设备

超净工作台（SW-CJ-1D）：购自苏州博莱尔净化设备有限公司；紫外分光光度计：购自北京普析通用仪器有限责任公司；恒温震荡摇床（THZ-98AB）和生化培养箱（LRH-70）：购自上海一恒科学仪器有限公司；超声仪（KQ-400E）：昆山市超声仪器有限公司；购自灭菌锅（BKQ-B50Ⅱ）：购自山东科博仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 不同抗菌肽产品和植物精油产品对致病菌的抑菌试验

1.2.1.1 抑菌圈测定

菌液制备：分别将大肠杆菌、嗜水气单胞菌、迟钝爱德华氏菌、无乳链球菌、维氏气单胞菌接种在营养平板上，副溶血弧菌接种在TCBS平板上，37℃培养24h；鰤鱼诺卡氏菌接种在TSA上，28℃培养。将培养后的单菌落接种至50mL的无菌营养肉汤液体培养基中，鰤鱼诺卡氏菌接种在BHI液体培养基中，分别震荡培养24h。

测试菌的配制：将上述测试菌培养液放置于常温后，置分光光度计于600nm处测吸光值至1.0，并将上述菌液稀释10倍备用。

培养皿制备：将灭菌后的营养肉汤培养基放置到60℃左右开始倒培养皿 ，每个培养皿倒15～20mL左右，倒好后水平静置使其在水平台面上凝固，备用。

样品制备：10%溶液制备：精密称定待测的试样5.00g，加入灭菌水45.00g，配制成10%溶液，40℃超声水浴15min使其溶解。吸取适量上述溶液于离心管中，10,000rpm离心5min，取上清液过0.45μm滤膜，滤液作供试样品溶液。

表3 不同抗菌肽产品和植物精油联合使用对致病菌的抑菌效果

试验菌的接种：用移液枪吸取步骤1.2菌悬液0.1mL，将其移至到已经倒好的营养琼脂培养皿内，用涂布棒涂布均匀，盖好培养皿。

添加抑菌剂：用消毒的打孔器在培养皿上打孔，各孔中心之间相距25mm以上，用移液枪吸取100μL溶液至琼脂孔内，盖好培养皿，正置培养。

结果的判定：经37℃培养箱中培养24h后，无透明的抑菌圈，则没有抑菌作用；有透明的抑菌圈，则有抑菌作用，抑菌圈越大表示样品对检测菌的抑制作用越强。

1.2.2 不同抗菌肽产品和植物精油产品对致病菌的最小MIC测定

选取上述试验中抑菌效果最好的植物精油作为后续试验所用的植物精油。采用二倍稀释法结合抑菌圈测定最小抑菌浓度，稀释后的浓度分别为1000、500、250、125、62.5ug/mL，然后按照1.2.1方法进行抑菌试验。培养结束后，查看加对应浓度的孔是否出现透明的抑菌圈，则最低浓度出现抑菌圈的浓度极为最小抑菌浓度。

1.2.3 不同抗菌肽产品和植物精油联合使用对致病菌的抑菌试验

根据抑菌试验结果，筛选出抑菌效果好的抗菌肽和植物精油产品，然后将抗菌肽产品和植物精油分别按1∶1进行复配，按1.2.1方法进行抑菌试验。

2 结果与分析

2.1 不同抗菌肽产品和植物精油产品对致病菌的抑菌试验结果

对所有收集的抗菌肽和植物精油样品进行的抑菌试验结果如表1，结果发现抗菌肽产品AP-1、AP-2、AP-4具有广谱抑菌作用，其中AP-1和AP-4抑菌作用更强。植物精油香芹酚、肉桂醛和百里香酚较桉叶素均有更好的抑菌作用。

表1 不同抗菌肽产品和植物精油产品对致病菌的抑菌效果

3 讨论

随着抗生素的禁用，绿色、安全、无残留的微生态制剂和植物提取物成为研究的焦点。目前，抗菌肽和植物精油已广泛用于医药、食品和化妆品行业。张静等发现百里香酚和香芹酚因其独特的芳香味对动物有很好的诱食作用，且具有很好的杀菌效果，其中丁香酚具有广谱抗菌性，特别是对大肠杆菌抑制效果最为明显。王新伟等研究表明，香芹酚、肉桂醛对大肠杆菌有明显的抑制作用。胡艳芬等研究发现，香芹酚对大肠杆菌有很好的抑制作用。张赟彬等发现肉桂醛影响细菌的膜通透性，而成倍数增长的核酸、蛋白质含量表示胞膜的完整性遭到破坏，

肉桂醛降低菌体膜电位，影响其代谢活性，从而抑制细菌生长，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有极强的抑菌作用。许君茹等发现抗菌肽对革兰阳性菌和革兰阴性菌均有一定程度的抑制作用，其对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的最小MIC分别为20ug/mL、20ug/mL和40ug/mL。而在本研究中抗菌肽AP-1和AP-4、植物精油香芹酚、肉桂醛和百里香酚对大肠杆菌的最小MIC为125ug/mL。罗振福等也报道了天蚕素对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌有明显的抑制作用。然而不同文献报道的植物精油和抗菌肽对细菌的最小MIC值存在一定的差异，这可能与不同厂家的抗菌肽和植物精油的纯度有关。这与本试验抑菌结果及最小MIC结果一致，不同厂家抗菌肽和植物精油对不同致病菌的抑菌作用有所差异，其对致病菌的抑菌作用越强，其最小MIC越小，反之亦然。

为验证植物精油单独使用时和其它抑菌分子联合起来使用的效果对比，众多学者开展相关研究。张皓然等报道，植物精油与柠檬酸复合使用时具有协同作用，对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌均有较好的抑制效果。王康莉将植物精油进行复配，使用牛津杯法研究其抑菌效果，研究报道将肉桂醛与香兰素按照 4∶1进行复配时，对金黄色葡萄菌与沙门氏菌表现出最强的抑制效果。在本研究中，抗菌肽AP-1和AP-4和4种植物精油分别按照1∶1进行复配，对各致病菌的抑菌作用较单一产品的抑菌作用效果显著提升。为产品抑菌效果提升提供新思路。

4 结论

本文研究了10个厂家生产的抗菌肽产品和4种植物精油对大肠杆菌、副溶血弧菌、 嗜水气单胞菌、迟钝爱德华氏菌、鰤鱼诺卡氏菌、无乳链球菌、维氏气单胞菌的抑菌作用，发现不同抗菌肽和植物精油的抑菌功能有极大差异，其中抗菌肽AP-1和AP-4抑菌作用最佳，植物精油除桉叶素以外，其它3个植物精油均有较强的抑菌作用。通过对抗菌肽AP-1和AP-4及植物精油香芹酚、肉桂醛和百里香酚对致病菌的最小抑菌浓度检测，发现植物精油对各菌的最小抑菌浓度基本在125ug/mL就有抑菌作用，抗菌肽AP-1和AP-4对不同菌的最小抑菌浓度有较大差异，基本在125ug/mL～500ug/mL之间。对抗菌肽AP-1、AP-4和4种植物精油之间的相互作用也进行了研究，AP-1、AP-4和4种植物精油复配后对各致病菌的抑菌作用较单一产品的抑菌作用效果显著提升，表明它们之间存在协同增效的作用，为实际产品应用提供可行性参考。