双波长HPLC法测定藤黄健骨片中地黄苷D、水晶兰苷的含量

董清,支荣荣（江苏省盐城市食品药品监督检验中心,江苏 盐城 224055）

藤黄健骨片现行质量标准为国家食品药品监督管理局标准YBZ07942009[1]，由熟地黄、鹿衔草、骨碎补、肉苁蓉、淫羊藿、鸡血藤、莱菔子七味中药组成，具有补肾、活血、止痛之功效。现行标准建立了HPLC测定淫羊藿苷含量，对于熟地黄、鹿衔草两味主要组方仅建立了TLC鉴别法。王艳[2]等人补充建立了HPLC测定柚皮苷含量，显微鉴别淫羊藿和鹿衔草。未见文献报道对该制剂中熟地黄、鹿衔草两味主要组分进行含量测定。

熟地黄中活性成分地黄苷D具有滋阴补血和降血糖的作用[3]，鹿衔草中活性成分水晶兰苷能抑制去卵巢大鼠模型中骨量减少，其可能具有抑制破骨细胞生成的能力[4-5]。王宥涵[6]等人通过建立体外破骨细胞的培养系，观察了水晶兰苷抑制破骨细胞生成的作用，并通过测定水晶兰苷对NFATc1的表达水平，探讨了可能作用的靶点。可见其药理作用与中医功效是相关的。

中国药典2020年版已经建立HPLC法测定熟地黄中地黄苷D、鹿衔草中水晶兰苷的含量[7]。有关文献对地黄苷D、水晶兰苷的测定方法也有报道[8-9]，本文主要参考中国药典建立的藤黄健骨片中地黄苷D、水晶兰苷两种成分的含量测定方法，为进一步提高质量标准提供参考。

1 仪器与材料

1.1仪器 Ultimate U3000型高效液相色谱仪，XS205DU电子天平，Milli-Q超纯水系统，KH-500E型超声仪，恒丰HH-4恒温水浴锅。

1.2材料 地黄苷D对照品（中国食品药品检定研究院，含量：94.2%）、水晶兰苷对照品（中国食品药品检定研究院，含量：96.2%）；磷酸、甲醇、水等均为色谱纯；藤黄健骨片（某企业三批次，规格：0.5g/片）。

2 实验方法与结果

2.1熟地黄、鹿衔草主成分的含量测定

2.1.1色谱条件[7]色谱柱：SVEA opal C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：甲醇为流动相A，0.1%磷酸为流动相B（5∶95）；检测波长：203nm（地黄苷D）、235nm（水晶兰苷）；柱温：30℃；流速：1.0mL·min-1；进样量均为10μl。

2.1.2对照品溶液的制备 取地黄苷D对照品15.94mg、水晶兰苷对照品11.23mg，分别置入100ml量瓶中，加25%甲醇溶液制成每1ml含地黄苷D0.1502mg、水晶兰苷0.1080mg的对照品储备溶液（供加样回收率试验用），分别精密吸取两种储备液1ml，置入10ml量瓶中，加25%甲醇溶液至刻度，制成含地黄苷D15.02μg、水晶兰苷10.80μg的对照品混合溶液（供含量测定及线性关系考察用）。

2.1.3供试品溶液的制备 取本品细粉约0.5g，精密称定，置入具塞锥形瓶中，精密加入25%甲醇溶液25ml，称定重量，回流1小时（80℃），放冷，再称定重量，用25%甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.4阴性对照溶液 按照质量标准制备工艺制备取缺熟地黄及缺鹿衔草的阴性样品，各取0.5g，同供试品溶液的制备方法制备。

2.1.5专属性试验 精密量取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10μl，按上述方法测定。结果表明，供试品在混合对照品溶液相应的位置有色谱峰，熟地黄阴性样品在地黄苷D的位置上无色谱峰，鹿衔草阴性样品在水晶兰苷的位置上无色谱峰。表明供试品中其他成分对目标成分无干扰，本方法有良好的专属性。见图1。

图1 高效液相色谱图。（1）地黄苷D、水晶兰苷混合对照品溶液；（2）供试品溶液；（3）熟地黄阴性对照溶液；（4）鹿衔草阴性对照溶液。注：A.地黄苷D，B.水晶兰苷

2.1.6线性关系考察 精密量取2.1.2对照品溶液1、2、4、10、16、20、30μl测定，以峰面积Y为纵坐标，对照品的质量X（μg）为横坐标，绘制标准曲线，计算得回归方程，结果表明，各成分在各自范围内与峰面积呈良好的线性关系。见表1。

表1 线性关系表

2.1.7精密度试验 精密吸取2.1.2对照品溶液，连续进样6次，地黄苷D、水晶兰苷峰面积的RSD分别为0.32%、0.88%（n=6），精密度良好。

2.1.8稳定性考察 吸取供试品溶液，于0、6、12、24、48h分别进样10μl，按上述条件测定，地黄苷D、水晶兰苷峰面积的RSD分别为0.50%、0.52%（n=2），供试品溶液在48h内稳定。

2.1.9重复性试验 精密称取同一样品，按供试品溶液制备方法平行制备6份，依次测定，地黄苷D、水晶兰苷的平均含量分别为0.4206mg·g-1、0.4522mg·g-1，RSD分别为0.88%、0.91%，重复性良好。

2.1.10加样回收率试验 精密称取已知含量的样品0.25g，六份，分别精密吸取2.1.2的地黄苷D、水晶兰苷对照品储备溶液各0.7mL（0.1051mg）、1.0mL（0.1080mg），按制备方法制得供试品溶液（对照品溶液体积代入公式计算含量）。分别吸取上述溶液各10μl测定回收率。见表2、表3。

表2 地黄苷D加样回收率试验结果(n=6)

表3 水晶兰苷加样回收率试验结果(n=6)

2.1.11样品含量测定 依2.1.1方法测定3批样品，结果见表4。

表4 样品含量测定结果(mg·g-1)

3 讨论

3.1色谱条件的选择 选择了中国药典2020年版一部熟地黄的流动相组分（鹿衔草的流动相组分与熟地黄相同）：甲醇为流动相A，0.1%磷酸溶液为流动相B（5∶95）。该流动相比例条件下地黄苷D和水晶兰苷分离度达到药典要求，供试品中与其他成分均能较好分离。

3.2供试品提取方法 地黄苷D在25%甲醇溶液中溶解性较好，水晶兰苷在水中溶解度较好[7]，兼顾两种成分的溶解性，本文采用25%甲醇溶液同时提取两种成分。药典熟地黄采取了超声处理方法，鹿衔草采用了水浴加热的方法，本文比较了超声和水浴回流，结果表明超声处理对水晶兰苷的提取效率较低，故采用了水浴回流（80℃）提取，本文还考察了溶剂体积、提取时间、回流温度等因素，最终确定了2.1.3供试品制备方法。