墨脱花椒种子休眠特性与解除方法

关文灵　张海立　荣辉　孟静

关键词：墨脱花椒；休眠解除；种子萌发；物理休眠；生理休眠

中图分类号：S573 文献标识码：A

墨脱花椒（Zanthoxylum motuoense）为芸香科（Rutaceae）花椒属（Zanthoxylum）落叶小乔木，产于西藏墨脱县境内，分布于海拔1000～1900 m的亚热带湿润气候地带[1]。其果实和叶片具有浓郁的香气，果实是西藏地区常用的香辛调料，用于烹制牦牛肉等食物。由于其风味独特，深受西藏人民的喜爱，主要用作烹饪调料，具有较高的经济价值和开发潜力，目前已成为墨脱县重点发展的特色经济林木[2]。由于墨脱花椒自然繁殖系数低，人工繁育困难，想要产业化发展，仅靠对野生资源的挖掘移栽不能满足市场需要，种苗缺乏问题亟待解决。因此，解决墨脱花椒的人工繁育问题，对墨脱花椒的种质资源保护及开发利用具有深远的意义。播种育苗具有繁殖系数高、操作方便的优点，但墨脱花椒种子存在休眠现象，自然条件下萌发困难，发芽率极低。有关墨脱花椒种子萌发特性的研究未见报道，只有对其分类学、形态学及扦插育苗技术[2]的相关研究报道。为了探究墨脱花椒种子的休眠原因和萌发特性，本研究以墨脱花椒种子为研究对象，通过对种子吸水性和萌发抑制物质的研究，探讨墨脱花椒种子休眠的原因；采用单因素试验设计探究不同温度和光照对种子萌发的影响，设置浓硫酸和GA3组合处理试验，筛选破除种子休眠及促进萌发的最佳处理方案，为墨脱花椒的播种育苗及综合开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究所用的墨脱花椒种子于2017 年10 月采收于西藏自治区林芝市墨脱县，将新鲜果实带回实验室晾干后去除果皮和杂质，收集纯净的种子干燥条件下保存备用。

1.2 方法

1.2.1 种子形态 随机取10 粒种子，在体式显微镜下观测种子形状、颜色以及横纵轴直径，将种子沿中心线切成两半，观察种子内部形态结构，重复3 次。

1.2.2 种子空壳率 采用水选法。随机取100 粒种子，放入盛有水的烧杯中，用玻璃棒适当搅拌，让全部种子充分浸没在水中，5 min 后统计上浮种子占试验种子的百分比，重复3 次。将下沉种子自然晾干备用。

1.2.3 种子千粒重 采用百粒法测千粒重[3]。从筛选后种子中随机取100 粒为1 组，共取8 组，分别称重，计算平均质量，转换成千粒重。

1.2.4 种子含水量 采用103 ℃低恒温干燥法[4]。从筛选后的种子中随机取30 粒为一组，在103 ℃烘干箱中将样品盒及盒盖质量烘干至不再变化，再称取样品盒和盒盖的重量M1，称取样品盒和盒盖及样品的烘前总重量M2，放入103 ℃烘干箱烘12 h，再取出稱取样品盒和盒盖及样品的烘后总重量M3。

1.2.5 种子生活力 采用TTC 法[5]。随机取10粒饱满种子，沿种子胚中心线切成两半，置于培养皿中，加入0.5%TTC 浸没种子，将培养皿放入30 ℃全黑暗恒温箱中24 h，胚被染成红色为有生活力的种子，重复3 次。

1.2.6 种子吸水性 分别随机取去皮种子、酸蚀种子（浓硫酸浸种10 min 后洗净晾干备用的种子）和完整种子各30 粒，分别称其干重，放在盛水的烧杯中浸泡，每4 h（白天）和10 h（晚上）取出一次，用滤纸吸干表面水分，用电子天平迅速称其湿重，直到种子质量不再增加为止停止试验，观测种皮对其吸水性的影响，每个处理重复3次。将酸蚀种子与完整种子在体式显微镜下进行外部形态对比观察。

1.2.7 种子发芽抑制物质测定 分别取10 g 完整种子和空壳种子磨碎，置于100 mL 容量瓶中，加80%甲醇定容至100 mL，在4 ℃恒温箱中浸提24 h，期间震荡3 次，然后充分过滤，滤液即为抑制物的提取液，分别稀释为原浓度的75%、50%、25%、0%，在室温下分别用稀释后的溶液浸泡白菜种子2 h， 再用0.1%高锰酸钾消毒10 min，用无菌水冲洗干净，置于直径9 cm 的培养皿中的滤纸上，在25 ℃恒温、光照条件为12 h光照/12 h 黑暗的培养箱中进行发芽试验。每个处理50 粒白菜种子，重复3 次，以胚根露出种胚为发芽标准，24 h 后统计发芽率。

1.2.8 种子休眠解除的方法 用0.1%高锰酸钾浸泡种子消毒10 min，后用无菌水冲干净，进行不同试验处理。将处理后的种子放入直径9 cm 装满湿润珍珠岩的培养皿中，分别置于培养箱中进行发芽试验，每个处理30 粒种子，重复3 次。试验期间每天观察，并保持珍珠岩湿润。参照《1996国际种子检验规程》的鉴定标准统计萌发情况，种子的萌发以胚根长度超过种子半径作为萌发标准，连续5 d 无萌发种子视为萌发结束。具体试验处理如下：

处理1（CK）：消毒后的种子未经其他处理，放置于培养箱中进行发芽试验。温度为25 ℃和15 ℃各12 h 循环。处理2（机械去皮处理）：用手术刀对种子进行去皮处理，将种仁取出进行发芽试验。发芽条件同上。处理3（低温沙藏处理）：随机取30 粒完整种子，用湿沙包裹，后置于4 ℃冰箱中，每个月检查其萌发情况，1 年后统计种子发芽率。处理4（常规播种处理）：随机取30粒完整种子，在深8 cm、内口径8 cm 的育苗盆中直接播种，再放置于大棚，用75%遮阳网覆盖，每个月检查其萌发情况，1 年后统计种子发芽率。处理5（浓硫酸+GA₃组合处理方案的优化筛选）：浓硫酸处理时间（T）设置4 个水平，分别为T₁（0 min）、T₂（5 min）、T₃（10 min）、T₄（15 min），GA₃浓度（G）设置5 个水平，分别为G₁（0 mg/L）、G₂（500 mg/L）、G₃（1000 mg/L）、G₄（1500 mg/L）、G₅（2000 mg/L），GA₃ 处理时间为48 h，共计20个处理，在30 ℃全时段黑暗条件的培养箱中进行发芽试验。处理6（温度对种子萌发的影响）：室温条件下，用浓硫酸处理种子10 min，在流水下反复搓洗干净，再结合1500 mg/L GA₃浸泡48 h，分别在30 ℃、25 ℃和15 ℃/25 ℃条件下，全时段黑暗的培养箱中进行发芽试验。

2 结果与分析

2.1 种子形态结构及千粒重

如图1 所示，墨脱花椒种子主要为卵圆形，少数半卵圆形，卵圆形种子种皮坚硬表面光滑，种脐位于其腹面中部，其横轴直径为（3.18±0.036）mm，纵轴直径为（3.86±0.04）mm。半卵圆形种子横切面光滑，横轴直径为（1.63±0.06）mm，纵轴直径为（3.83±0.02）mm。

如图2 所示，种子内部结构由三部分组成：种皮、胚、胚乳，胚为白色抹刀型。

种子空壳率为25.67%±2.40%，对上浮种子进行破壳处理，发现均为无胚的空壳，而下沉种子为饱满种子。饱满种子千粒重为（13.73±0.08）g，含水量为12.31%±0.62%，生活力为97.78%±1.11%，种子具备萌发的可能性。

2.2 种子吸水性

由图3 可知，在同一时间段内，去皮种子与完整种子相比，吸水率差异较大。去皮种子在0～4 h 阶段，为快速吸水阶段，吸水率为60.40%，在4～26 h 阶段为缓慢吸水阶段，在26 h 后吸水逐渐趋于平稳，最终吸水率为76.41%。而酸蚀种子与完整种子吸水曲线差异不大，各阶段吸水率接近持平，在0～4 h 阶段为快速吸水阶段，吸水率分别为9.95%和10.61%，4～30 h 吸水逐渐缓慢，后期逐渐接近吸水饱和， 最终吸水率分别为23.40%和21.19%。结果表明，墨脱花椒完整种子种皮透水性差，吸水速率慢，对种子萌发存在一定程度物理障碍，酸蚀处理后对种子吸水速率影响不大。

如图4 所示，经酸蚀处理后的种子与对照种子外部形态差异较大，酸蚀后的种子表面凹凸不平色泽暗淡，部分表面由于灼烧而产生裂痕，与对照种子表面光滑油亮形成鲜明对比。可见，浓硫酸浸种能去除种皮表面油脂物质，还能使种皮开裂，从而增强透水透气性。

2.3 种子发芽抑制物质的生物测定

由图5 可知，不同浓度的种皮和完整种子浸提液对白菜种子发芽率均有抑制作用，且随着浸提液浓度的增加，白菜种子发芽率呈现逐渐降低的趋势，且完整种子浸提液的抑制程度高于种皮浸提液。经方差分析和多重比较结果显示，当种皮浸提液浓度为25%和50%时，发芽率与对照相比均无显著差异（P>0.05），当其浓度为75%和100%时，与对照相比均存在显著差异（P<0.05），发芽率分别降低了87.34%、92.67%，表明当种皮浸提液达一定浓度（≥75%）时，才具有抑制作用；而完整种子浸提液濃度在25%、50%、75%、100%时，与对照相比均存在显著差异，发芽率分别降低了19.33%、44%、88.66%、92.66%；完整种子浸提液与种皮浸提液相比，在浸提液浓度为25%、50%、75%和100%时，白菜种子发芽率均低于种皮浸提液，且在25%和50%时均存在显著差异，而完整种子由种皮和种仁构成，说明种胚内部也存在抑制物质。由此可知，种皮和完整种子的甲醇浸提液对白菜种子均存在抑制作用，抑制物质主要分布在种仁和种皮，抑制强度为完整种子>种皮，且随浸提液浓度增加，抑制作用增强。

2.4 促进种子萌发方法

2.4.1 物理处理 通过试验得出，对照、机械去皮、低温沙藏、常规播种4 种处理后的种子均未萌发。可见，墨脱花椒种子不易萌发，存在休眠性。

2.4.2 化学处理 由表1 可知，当浓硫酸处理时间（T）为0 时，无论GA3 浓度（G）有多大，种子都不会萌发，与对照（T1G1）结果一致，说明单独的GA3 处理对种子萌发没有促进作用。当GA3 浓度为0 mg/L（G1）时，浓硫酸处理时间为5 min（T2）和10 min（T3）时，种子发芽率分别为4.44%和3.33%，与对照相比不存在显著差异，说明单独的浓硫酸处理对种子萌发没有实质性促进作用。在经浓硫酸处理5～15 min 后，随着GA3处理浓度的增大，种子发芽率呈现先增后降的趋势，在GA3 浓度为1500 mg/L（G4）时，种子发芽率达到最高。其中浓硫酸浸泡10 min+1500 mg/LGA3 浸泡48 h（T3G4）的组合处理发芽率最高，达83.33%；其次是浓硫酸浸泡15 min+1500 mg/LGA3 浸泡48 h 的组合处理（T4G4），发芽率为77.78%，上述2 个处理的效果无显著差异，但与其他处理间均达到差异显著水平。由此可知，浓硫酸和GA3 共同作用可解除墨脱花椒种子休眠，促其萌发，2 种药剂单独处理时均不能有效解除种子休眠。

2.4.3 温度 由表2 可知，30 ℃条件下种子的发芽率、发芽势和发芽指数均为最高。其中，30 ℃发芽势与发芽指数均显著高于25 ℃ 和25 ℃/15 ℃，发芽率只显著高于25 ℃/15 ℃，与25 ℃差异不显著。综合来看，温度也是影响墨脱花椒种子萌发的一个重要因素，30 ℃条件更适合其萌发。

3 讨论

本研究发现，墨脱花椒种子具有较高的空壳率，达25.67%。在实践生产中，种子的结实率主要受到播种、施肥、灌溉、病虫害防治、辅助授粉等多种因素的影响[7]。而在自然条件下，种子产量和质量主要受环境影响，其中气候条件是影响种子生产的关键因素，包括光照、温度、降雨量等[8-9]。资料显示，墨脱花椒在全世界仅分布于中国西藏的墨脱县[1]。西藏墨脱地区具有青藏高原独特的地理环境和特殊的气候条件，雨量十分充沛，年降雨量达2000～3000 mm，属于喜马拉雅山东侧亚热带潮湿气候区[10-11]。推测原产地湿热的气候影响了传粉受精，这可能是造成墨脱花椒种子空壳的主要原因。刘元生等[12]研究顶坛花椒成苗技术时，选用的种子采收自环境恶劣的喀斯特温热河谷区，花椒种子的空壳率高达70%～90%；崔星星[13]在研究竹叶花椒种子休眠特性时，发现采自四川不同地区的花椒种子空壳率均高达50%以上。可见，不同的环境条件对花椒种子结实都会造成一定影响，而环境条件如何影响花椒种子空壳则还需进一步探究。

种子萌发过程不仅受到自身遗传因素和形态特征的影响，还受到光照、温度、水分、化学物质等外界环境条件的调控[14]。已有研究证明，种子萌发的最适温度通常和原生境气候条件具有很大的关系[15]，也有可能与植物本身有关[16-17]。本研究发现，墨脱花椒在30 ℃条件催芽时发芽率、发芽势及发芽指数都最高，说明30 ℃为发芽最适宜温度。墨脱地区昼夜温差大，最热月平均气温30.1 ℃，较为接近发芽最适温度。甘肃[18]、山东[19]两地的大红袍花椒催芽时也是选择30 ℃恒温黑暗条件，在此条件下发芽率较高。这一原因是否是花椒属植物本身的遺传特性还需深入探讨。

种子吸水性试验结果显示，去皮种子的吸水率在72 h 内高达76.41%，而完整种子的饱和吸水率仅为21.19%，说明种皮严重阻碍了墨脱花椒种子的吸水性。经浓硫酸处理后的种子饱和吸水率为23.40%，与完整种子的接近，这可能与酸蚀种子流水清洗时种子已充分吸水及流水洗净后未完全晾干有关。对比完整种子，酸蚀种子表面已经出现裂痕，种皮已难以阻碍吸水透气。蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）[20]、巨紫荆（Cercis giganteaCheng et Keng f.）[21]、东北红豆杉（Taxuscuspidata Sieb. et Zucc.）[22]等种子也都存在类似的吸水障碍。由此可见，种皮的透水性障碍是墨脱花椒种子休眠的原因之一。

抑制物质存在于种子的各个部位，包括果皮、种皮、胚、胚乳部位，其中脱落酸是这些部位最常见的抑制物质[23]。本研究通过甲醇对抑制物质进行提取。结果表明，墨脱花椒种子种皮和种仁中都存在抑制物质，且随着浸提液浓度的增大抑制作用逐渐增强。这与青花椒种子抑制物测定结果一致[13]，但青花椒种子不同部位的抑制强度表现为种仁>种皮，对于墨脱花椒种子种皮和种仁的抑制强度及抑制物类型都需要进一步探究。

根据休眠因素所在种子部位的角度可将种子休眠分为内源休眠、外源休眠和综合休眠[24-25]。墨脱花椒种子的种皮存在吸水障碍，属于外源因素；种子存在萌发抑制物质，属于内源因素。由此认为墨脱花椒种子属于综合休眠类型。在破除休眠的方法中，酸蚀处理有利于增加种皮透水性而解除其外源限制因素，GA3 处理可能有助于消减发芽抑制物质而解除其生理休眠（内源休眠）。

综上，本研究认为由种皮造成的吸水障碍和种子含有内源抑制物是引起墨脱花椒种子休眠的主要原因，其休眠类型属于复合休眠（PY+PD）。浓硫酸处理10 min+1500 mg/L GA₃浸种48 h+30 ℃恒温培养可有效解除墨脱花椒种子休眠，提高其发芽率。研究结果为墨脱花椒人工繁育提供了科学依据。