柑橘抗逆基因MYB96的克隆与表达分析

李 潇,郭文芳,杨 莉,胡 威,匡柳青,刘德春,刘 勇

(江西农业大学 农学院,江西 南昌 330045)

柑橘的栽植面积及产值在我国果树产业中占据着非常重要的地位,但其分布范围和生长发育会受到低温、干旱、高盐等非生物胁迫的制约[1]。植物体中的转录调控可以通过将转录因子与下游基因顺式作用元件结合从而调控下游基因表达,在植物适应不同逆境胁迫的过程中发挥关键作用[2-3]。因此,对柑橘响应逆境胁迫相关转录因子的研究具有重要的理论和实践意义。

MYB家族转录因子均含有保守的MYB结构域,根据其保守结构域N端所包含的R结构的数量,MYB转录因子可以分为4个亚家族:1R-MYB、R2R3-MYB、R1R2R3-MYB和4R-MYB[4-5]。近年来研究表明,R2R3-MYB转录因子具有调控脂质[6]、木质素[7]、花青素[8]以及黄酮醇[9]等多种代谢物合成的功能。同时,R2R3-MYB转录因子在植物响应高盐[10]、干旱[11]、高温[12]和低温[13]胁迫过程中也发挥了重要的作用。

研究表明,拟南芥AtMYB96转录因子可以直接结合在编码脂肪酸延伸酶(如KCS、KCR和ECR)的基因启动子上,调控植物表皮蜡质的生物合成,从而增强转基因植物抗旱性,并保护其免受病理性和机械性损伤[14-15]。目前,月季(Rosahybrida)[16]、苹果(Maluspumila)[17]、山茶(Camelinasativa)[18]等植物的MYB96在基因表达和抗逆功能上的研究已有报道。

在柑橘中,关于MYB96转录因子的研究主要集中在调控甜橙外果皮蜡质生物合成以及减少采后甜橙果实失水的功能上[19]。为探索柑橘MYB96基因在响应逆境胁迫中的功能,本研究从不同的柑橘种类:甜橙、柠檬、金柑和芦柑中克隆得到4个MYB96基因,对其生物信息学以及在不同种类的柑橘和不同逆境胁迫条件下的表达模式进行分析,为阐明MYB96基因在柑橘中响应非生物胁迫应答的作用奠定了理论基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

参照卢婷等[20]的方法,培养甜橙(Citrussinensis(L.)Osbeck.)、柠檬(Citruslimon(L.)Burm.f.)、金柑(Fortunellamargarita(Lour.)Swingle.)、芦柑(CitrusreticulataBlanco.)等4种柑橘材料的实生幼苗。幼苗培养28 d左右后,再用Hoagland液体营养液预培养3 d,之后进行非生物胁迫处理。将幼苗分别移置含有20% PEG6000和含有250 mmol/L NaCl的Hoagland液体营养液中进行干旱和高盐处理。低温处理则是将4种柑橘幼苗材料转移到干净的Hoagland营养液后,置于4 ℃培养箱中培养。每种处理用柑橘幼苗25株,以室温(25 ℃)Hoagland 液体培养未做处理植株做对照(0 h),分别在3种处理1,3,6,12,24 h取其叶片,液氮速冻,-80 ℃储存备用。试验均进行3个生物学重复。

1.2 叶片总RNA提取及反转录

叶片总RNA提取、纯度检查和完整性评估按照郭文芳等[21]描述的方法进行。按照日本TOYOBO公司的反转录试剂盒说明书将总RNA反转录成cDNA,存放于-20 ℃,备用。

1.3 CsMYB96、ClMYB96、FmMYB96和CrMYB96基因克隆

在华中农业大学甜橙基因组数据库查找获得甜橙CsMYB96基因cDNA序列,使用Primer Premier 5.0设计引物CsMYB96-F和CsMYB96-R(表1),以甜橙、柠檬、金柑和芦柑叶片第一链cDNA为模板,进行PCR扩增,得到CsMYB96、ClMYB96、FmMYB96和CrMYB96基因扩增产物,插入pMD18-T 载体并转化到大肠杆菌中,菌液PCR鉴定为阳性后进行测序。引物设计和PCR扩增程序参照郭文芳等[21]的方法。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.4 生物信息学分析

在NCBI网站中的ORF Finder程序中获取4个柑橘MYB96基因cDNA序列编码区长度与氨基酸数量。在NCBI网站中的Blast程序进行氨基酸序列比对查找同源蛋白,利用SMART在线软件进行蛋白序列保守结构域分析,并利用MEGA 7.0软件中NJ法构建系统进化树。蛋白理化性质利用ExPASy ProtParam在线分析工具分析预测;蛋白质二级及三级结构的预测分别利用SOPMA和SWISS MODEL完成;亚细胞定位用在线网站CELLO完成。甜橙CsMYB96基因上的启动子分析利用Plant CARE在线网站完成。

1.5 实时荧光定量PCR

基于完成测序的CsMYB96基因序列,利用Primer Premier 5.0软件,设计CsMYB96基因实时定量引物qCsMYB96-F和qCsMYB96-R,内参基因为柑橘Actin基因(表1)。反应体系和程序参照TaKaRa公司的荧光定量试剂盒说明书,每个样品3次重复,利用2-ΔΔCT方法计算相对表达量。

2 结果与分析

2.1 CsMYB96、ClMYB96、FmMYB96和CrMYB96基因克隆及序列分析

通过PCR扩增,分别从甜橙、柠檬、金柑和芦柑的cDNA中克隆出MYB96序列,并分别命名为CsMYB96、ClMYB96、FmMYB9和CrMYB96。测序结果和序列分析结果表明,CsMYB96和CrMYB96的cDNA全长分别为1 215,1 214 bp,均含有1 032 bp的开放阅读框,编码343个氨基酸。ClMYB96和FmMYB96的cDNA全长均为1 218 bp,含有1 035 bp的开放阅读框,都编码344个氨基酸。

2.2 CsMYB96、ClMYB96、FmMYB96和CrMYB96蛋白序列分析

对CsMYB96、ClMYB96、FmMYB96和CrMYB96蛋白的理化性质进行分析,结果表明,CsMYB96和CrMYB96蛋白分子量分别约为38.16,38.13 ku,理论等电点均为6.31;ClMYB96和FmMYB96蛋白分子量分别约为38.27,38.22 ku,理论等电点均为6.35。亚细胞定位预测结果显示,4个MYB96蛋白核定位的预测分值均显著高于非核定位预测分值,可以预测CsMYB96、ClMYB96、FmMYB96和CrMYB96蛋白定位于细胞核(表2)。一般认为总平均亲水性系数小于0属于亲水性蛋白,预测结果显示,这4个蛋白的不稳定指数分别为51.48,50.78,49.38,52.15,总平均亲水性系数分别为-0.751,-0.766,-0.757,-0.762,所以推测它们都是不稳定亲水性蛋白。再通过ProtScale在线软件对其进行进一步的蛋白亲疏水性预测,结果表明平均得分小于0,进一步证明它们均为亲水性蛋白质(图1-A)。

A.亲疏水性分析;B.三级结构预测模型;C.磷酸化位点预测。A.Hydrophilicity and hydrophobicity analysis;B.Three dimensional structure prediction model;C.Phosphorylation site prediction.图1 CsMYB96蛋白预测分析Fig.1 Prediction and analysis of CsMYB96

对CsMYB96、ClMYB96、FmMYB96和CrMYB96蛋白二级结构的预测结果如表2所示,这4个蛋白的二级结构相似,主要含有α螺旋和无规卷曲。因此,以CsMYB96蛋白为例,使用SWISS-MODEL在线工具获得了CsMYB96蛋白三级结构模型,发现CsMYB96蛋白主要由螺旋和无规卷曲构成(图1-B),与SOPMA中的二级结构分析结果一致。

表2 CsMYB96、ClMYB96、FmMYB96和CrMYB96蛋白亚细胞定位预测及二级结构信息Tab.2 Subcellular localization prediction and secondary structure information of CsMYB96,ClMYB96, FmMYB96 and CrMYB96

对CsMYB96蛋白磷酸化位点预测结果表明,CsMYB96中丝氨酸磷酸化位点最多,约27个,苏氨酸磷酸化位点约13个以及6个酪氨酸磷酸化位点(图1-C)。因此,推测该基因主要通过丝氨酸磷酸化修饰调控其功能。

2.3 不同种类柑橘MYB96蛋白的同源性及系统进化分析

利用DNAMAN软件将CsMYB96、ClMYB96、FmMYB96、CrMYB96蛋白与其他植物MYB蛋白氨基酸序列比对,结果显示,这4条氨基酸序列有5个位点存在差异,序列一致性达99.56%,且与拟南芥AtMYB96、AtMYB94、山茶CsMYB96、芜菁BrMYB96和盐藻EuMYB96蛋白同源性较高,均具有高度保守的R2和R3结构域(图2短线标出)。在R2和R3结构域中,均含有3个分别间隔19个碱基和间隔18个碱基的保守色氨酸(W)残基,但在R3结构域中,第一个色氨酸(W)被苯丙氨酸(F)所取代(图2中用▲标出)。利用SMART在线软件对这4个柑橘MYB96蛋白序列的分析结果显示,它们的保守结构域分析结果一致很高,即氮端13—63位氨基酸和66—114位氨基酸的位置上含有2个SANT保守结构域;在碳端233—249位和258—274位氨基酸处含有2个低复合物区域,图3中以甜橙CsMYB96蛋白的保守结构域分析结果为例。

图2 多种植物MYB蛋白氨基酸序列比对Fig.2 Amino acid sequence alignment of MYB proteins in several plants

图3 CsMYB96保守结构域分析Fig.3 CsMYB96 conserved domain analysis

同时利用MEGA 7.0对甜橙CsMYB96、柠檬ClMYB96、金柑FmMYB96、芦柑CrMYB96 蛋白与其他藻类、苔藓、单子叶和双子叶植物的MYB类似蛋白序列进行系统发育进化树的构建。结果表明,CsMYB96、ClMYB96、FmMYB96和CrMYB96蛋白与同为芸香科柑橘属的克莱门氏小柑橘CcMYB96蛋白(XP 006440595.1)亲缘关系最近;与拟南芥AtMYB96同属于双子叶植物分支,亲缘关系较近;与其他不同种类的植物MYB类似蛋白的系统进化关系符合植物由藻类到苔藓再到被子植物(单子叶植物、双子叶植物)的进化历程(图4)。

图4 CsMYB96、ClMYB96、FmMYB96、CrMYB96与其他植物MYB蛋白的系统进化树Fig.4 Phylogenetic tree of CsMYB96,ClMYB96,FmMYB96,CrMYB96 and MYB proteins in other plants

2.4 CsMYB96基因启动子顺式元件分析

利用PlantCARE对CsMYB96基因转录起始点上游2 000 bp的启动子序列进行顺式作用元件分析,结果表明,CsMYB96基因的启动子除了含有TATA-box和CAAT-box这些基本的启动子核心启动元件外,还含有光响应元件如G-Box、AT1-motif、TCCC-motif等,以及多种非生物胁迫响应相关顺式作用元件,主要有脱落酸响应元件(ABRE)、低温响应元件(LTR)、厌氧响应元件(ARE)、参与干旱诱导的MYB结合位点(MBS)等(表3),这说明CsMYB96基因可能在柑橘抵御非生物胁迫时发挥作用。

2.5 CsMYB96、ClMYB96、FmMYB96和CrMYB96在非生物胁迫处理后的表达分析

对甜橙、柠檬、金柑和芦柑分别进行4 ℃低温、20% PEG6000和250 mmol/L NaCl处理,取其叶片进行实时荧光定量表达分析(图5)。

A—C.甜橙叶片;D—F.柠檬叶片;G—I.金柑叶片;J—L.芦柑叶片。不同小写字母表示各处理间差异显著(P<0.05)。A—C.Sweet orange leaves;D—F.Lemon leaves;G—I.Kumquat leaves;J—L.Ponkan leaves.Different lowercase showed significant difference among treatments(P<0.05).图5 柑橘MYB96在低温、干旱、高盐处理下的表达模式Fig.5 Expression pattern of citrus MYB96 under low temperature, drought and high salt treatment

4 ℃低温胁迫下,叶片中甜橙CsMYB96和芦柑CrMYB96基因表达趋势一致,均为先下降后上升再下降,两基因表达量最高值均为处理后6 h。其中甜橙CsMYB96基因表达量在4 ℃低温处理后变化更显著,约为对照的2.5倍;同时,芦柑CrMYB96在叶片中表达量也上升至最高值,略大于对照;这2个基因的表达量在除处理6 h外的其他处理时段均低于对照。而柠檬ClMYB96、金柑FmMYB96的表达量在低温胁迫处理后均低于对照,说明这2个基因的表达受到了低温胁迫的抑制。

20% PEG6000模拟干旱胁迫处理时,叶片中甜橙CsMYB96和柠檬ClMYB96基因表达在处理0～12 h趋势一致,均为先下降后上升再下降,且两基因表达量最高值均为处理后6 h。其中,甜橙CsMYB96在处理6 h的表达量约为对照的3倍;处理后24 h,其表达量恢复到处理前的水平。柠檬ClMYB96在处理6 h的表达量为对照的2倍左右;之后在处理12 h其表达量下降至与对照无显著差异,但在处理24 h表达量再次出现小高峰,约为对照的1.5倍。而金柑FmMYB96和芦柑CrMYB96基因表达量在模拟干旱胁迫处理后总体下降。

250 mmol/L NaCl 胁迫处理时,甜橙CsMYB96在叶片中的表达量在处理1～3 h显著下降;处理6 h,甜橙CsMYB96被诱导上调表达,表达量达到最大值,之后表达量又逐渐降低。高盐处理下,柠檬ClMYB96在叶片中的表达量被诱导表达,整体表达量均显著高于对照。金柑FmMYB96的表达量在高盐处理的短时间内被抑制,处理6 h,其表达量显著上升,且高盐处理24 h,其表达量达到最大值,约为对照的2.6倍。芦柑CrMYB96基因表达量在高盐处理下整体受到抑制。

3 结论与讨论

在植物响应非生物胁迫的过程中,MYB转录因子处于调控中心位置,能够调控大量下游抗逆基因表达,进而保护自身免受各种逆境胁迫的危害[22]。近年来,对MYB家族转录因子,尤其是R2R3-MYB亚家族转录因子在非生物胁迫调控中的作用机制有了较为深入的研究,越来越多的MYB家族转录因子被证实参与了植物非生物胁迫的调控。为探究MYB96基因在柑橘中是否也参与逆境调控过程以及在不同品种中是否存在差异,从甜橙、柠檬、芦柑、金柑中分别克隆出CsMYB96、ClMYB96、FmMYB96和CrMYB96基因,并利用生物信息学方法对这4个柑橘MYB96基因序列进行了保守性和系统进化分析,以及蛋白结构预测和亚细胞定位预测。氨基酸序列分析结果显示,这4个柑橘MYB96蛋白都具有R2R3类MYB转录因子特有的2个高度保守SANT结构域(R2和R3),这与赵先炎等[17]研究结果一致,表明克隆结果真实可靠。同时,蛋白质理化性质分析表明,这4个蛋白均为不稳定亲水蛋白,易溶解。这与马尾松[23]和菠萝[24]中R2R3-MYB 转录因子的研究结果一致。此外,系统进化树结果表明,4个柑橘品种间遗传关系较近,位于同一分支。并与同属植物CcMYB96亲缘关系最近,与拟南芥AtMYB96同位于双子叶植物这一大分支上,亲缘关系较近。而与苔藓和藻类植物MYB蛋白亲缘关系较远,这符合植物系统分类学的进化趋势。

有研究表明,MYB转录因子可以同时参与多种胁迫信号响应,例如,过表达MdSIMYB1基因可以同时提高转基因烟草和苹果对干旱、低温和盐胁迫的耐受性[25]。在本试验中,CsMYB96基因启动子序列中包含多个植物逆境胁迫应答相关作用元件,如脱落酸响应元件、低温响应元件、参与干旱诱导的MYB结合位点(MBS)。非生物胁迫处理表达分析结果也表明,经过4 ℃低温、PEG模拟干旱胁迫处理6 h后,甜橙CsMYB96基因表达量上升。由此推测,CsMYB96基因可能同时受这2种非生物胁迫的诱导表达,参与植物非生物胁迫响应过程。

近年来,已报道的R2R3-MYB转录因子大多作为正调控因子参与非生物逆境响应,例如,拟南芥AtMYB96能够响应干旱胁迫[14];番茄中R2R3-MYB转录因子LeAN2会受低温氧化胁迫诱导表达,过表达该基因能够促进花青素的积累,增强了其对低温和氧化胁迫的抵抗力[26];水稻OsMYB55和OsMYB91能够分别响应高温和高盐胁迫。与野生型相比,过表达OsMYB55和OsMYB91植株分别表现出较强的高温和高盐耐受性[27-28]。本研究中实时荧光定量PCR分析表明,柠檬ClMYB96、金柑FmMYB96与芦柑CrMYB96对于相同逆境胁迫做出的响应有所差异。柠檬ClMYB96和金柑FmMYB96基因在经250 mmol/L NaCl胁迫处理后,叶片中的表达量都有明显提高。由此推测,柠檬ClMYB96和金柑FmMYB96可能作为正调控因子,参与高盐胁迫的响应过程。但是,低温、干旱和高盐胁迫后,芦柑CrMYB96基因的表达量在较短时间内受到了抑制。这与甘蔗R2R3-MYB基因Sc2RMyb1在受到NaCl胁迫后,表达量被抑制而明显下调的结果相似[29]。植物应对非生物胁迫时,往往有许多基因参与调控,同一个基因发挥的作用也不相同。冯莹莹等[30]研究表明,在盐胁迫处理下,白木香AsMYB2表达量显著上升;而在低温胁迫处理下,AsMYB2表达量显著降低。因此,可能是柠檬ClMYB96、金柑FmMYB96与芦柑CrMYB96在不同的胁迫处理下发挥的作用不同,导致其表达量受到诱导或抑制;而这3个MYB96基因对相同的胁迫处理做出的响应表现有所差异,则可能与柠檬、金柑和芦柑这3个柑橘种类自身遗传特性差异有关。

综上所述,本研究克隆获得了4个不同种类柑橘的MYB96基因,对其进行了生物信息学分析,并预测到CsMYB96启动子含有多个胁迫相关元件。然后,进一步通过qRT-PCR试验证明了这些基因受低温、干旱和高盐胁迫诱导或抑制表达。本研究为进一步鉴定柑橘中MYB96基因的抗逆功能奠定了基础。