番茄SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因的克隆及低温胁迫下的表达分析

王 鹏,田哲娟,赵雪芳,康 忱,吴志明,2,李亚栋,2,黄冀楠

(1.河北省农林科学院 经济作物研究所,河北 石家庄 050051;2.河北省蔬菜工程技术研究中心,河北 石家庄 050051; 3.河北省农林科学院 粮油作物研究所,河北 石家庄 050035)

番茄(Solanumlycopersicum)是喜温蔬菜,在全世界范围内广泛种植。其生长发育所需的最适温度在18～25 ℃,对低温比较敏感。低温胁迫严重影响番茄植株健康,甚至导致植株死亡[1]。冬春季节,设施种植的番茄极易受到低温影响,番茄品质和产量无法得到保证,低温限制了番茄的周年连续生产[2]。因此,生产上迫切需要耐寒的番茄品种,开展番茄耐寒研究和选育新品种显得尤为重要。

钙是植物体生长发育所必需的营养元素,钙离子(Ca2+)是一种重要的第二信使,在植物生长发育和抗逆反应中发挥重要作用。Ca2+的浓度变化可以精确反映外部环境和内源激素的变化,是启动钙离子信号通路的中心环节[3-4]。钙调蛋白(Calmodulin,CaM)是一种分布广、功能多、分子结构保守的Ca2+靶蛋白,在钙离子信号途径中扮演重要角色。CaM通常由149个氨基酸组成,含有4个能够与Ca2+结合的螺旋环螺旋(Helix-loop-helix)构成的EF-hand结构域[5-6]。CaM可以与Ca2+结合来影响Ca2+浓度,同时结合后所形成的复合体还可以激活钙离子信号通路中一系列下游蛋白,进而调控植物生长发育及反应外界刺激[7-8]。

大量研究证明,CaM在植物响应低温胁迫中具有非常重要的作用。Ca2+-CaM介导的信号转导途径通过与NO、活性氧系统(ROS)以及MAPKs(Mitogen-activated protein kinases)交互作用,进而建立植物的耐低温应答[9]。天山雪莲SikCML7参与了天山雪莲对低温、干旱和盐胁迫响应的过程[10]。在麻风树(JatrophacurcasL.)中证实CaM可通过提高植株脯氨酸含量,进而改善植株的低温耐受性[11]。近年来,通过生物技术手段,进一步证明CaM在提高植物的抗低温胁迫上的重要作用。Zhang等[12]将一种南极鱼的CaM基因片段转入烟草后,可显著增加转基因植株在0 ℃或4 ℃下的PS Ⅱ光合效率,明显提高转基因植株的抗低温能力。在番茄中,类CaM蛋白SlCML37过表达可显著改善了果实的低温耐受性[13];而过表达SlCML44的番茄植株表现出优异的耐低温能力,低温胁迫下种子萌发率和幼苗生长情况显著优于对照植株[14]。Zhao等[15]鉴定的番茄CaM基因家族中发现SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因的CDS序列虽然不同,但却能编码相同的蛋白,并对多种胁迫刺激具有高敏感性。然而利用CaM基因探讨番茄耐寒性的研究却鲜有报道。

目前,番茄耐寒品种的选育工作仍以常规杂交育种为主,具有选育时间长、杂交不亲和等缺点。CaM在众多植物耐低温方面的贡献为番茄耐寒品种的选育提供了新的思路。针对SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因的CDS序列和蛋白序列进行生物信息学分析,并预测启动子顺势作用元件。利用qRT-PCR技术探究SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因在不同番茄品种中低温胁迫下的表达模式。以期为CaM基因在番茄耐低温方面应用,培育番茄新品种提供技术基础和理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

以番茄品种Heinz1706、LA3969、冀粉2号、冀粉3号和农博粉霸15为试验材料。其中Heinz1706和LA3969引自TGRC(Tomato Genetics Resource Center,番茄遗传资源中心);冀粉2号和冀粉3号为河北省农林科学院经济作物研究所生物技术室选育,对低温具有较高耐受性;农博粉霸15为石家庄农博士科技开发有限公司(河北)培育的商用品种。

1.2 试验方法

1.2.1 处理方法 分别选取饱满、大小一致的供试材料种子20粒,经消毒、杀菌后于2020年10月16日浸种,10月21日播种于日光温室。模拟田间环境(25 ℃,光周期12 h/12 h,光照强度为50 000 lx,相对湿度60%)培养生长21 d。①取Heinz1706品种幼苗叶片组织保存于-80 ℃,提取RNA用于克隆SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因。②5种供试材料各选取长势一致的植株10株,分为2批,每批材料5株,分别转移至5, 15 ℃的培养箱中,光周期均设置为12 h/12 h,光照强度为50 000 lx,相对湿度60%,处理至0 ,0.25,0.5,1,2,4,8,12,24,48 h时取幼苗叶片于-80 ℃保存,提取RNA,上述处理每组取3次生物学重复,用于研究SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因在低温胁迫下的表达模式。

1.2.2 总RNA 提取及反转录 按照Plant Total RNA Isolation Kit 试剂盒(成都福际生物技术有限公司)说明要求提取上述所取材料的总RNA,使用NanoDrope 2000微量紫外分光光度计(Thermo Fisher Scientific)和1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA浓度和质量,使用Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)试剂盒将RNA反转录为cDNA,并将浓度稀释为100 ng/μL,置于-20 ℃冰箱保存备用。

1.2.3 番茄CaM3、CaM4和CaM5基因的克隆SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5的CDS序列参照参考文献 [15]。SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5的cDNA序列收集自SGN数据库(https://solgenomics.net/),对应的序列编号分别为Solyc10g077010.1.1、Solyc11g072240.1.1和Solyc12g099990.1.1。利用Primer Premier 5.0软件跨基因编码区设计特异性PCR引物(表 1)。

表1 引物信息Tab.1 Primer information

以Heinz1706品种幼苗叶片cDNA为模板,利用SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因的特异性引物进行PCR扩增。按照EasyTaq®DNA Polymerase(北京全式金生物技术有限公司)说明要求配置PCR扩增体系(25 μL):10×EasyTaq® Buffer 2.5 μL,dNTPs(2.5 mmol/L) 2 μL,EasyTaq® DNA Polymerase 0.3 μL,正向引物(10 μmol/L) 1 μL,反向引物(10 μmol/L) 1 μL,模板cDNA(100 ng/μL) 2 μL,加ddH2O补至25 μL。反应程序:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,35个循环;72 ℃延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测,使用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,使用E.Z.N.A Gel Extraction Kit(OMEGA)试剂盒回收目的片段。并由华大基因(北京)测序。

1.2.4 番茄CaM3、CaM4和CaM5氨基酸序列分析 利用DNAMAN(ver.6.0)软件将SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因翻译为蛋白质序列,利用Protparam软件(https://web.expasy.org/protparam/)进行蛋白理化性质分析,利用在线SOPMA工具(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)预测蛋白质二级结构,通过NCBI中的CDD(Conserved domain database)数据库和SMART在线结构域筛查工具(http://smart.embl-heidelberg.de/)预测蛋白保守结构域。

1.2.5 番茄CaM3、CaM4和CaM5基因启动子区顺式作用元件分析 参考番茄CaM3、CaM4和CaM5基因的CDS序列及基因组序列,截取起始密码子上游2 kb的基因组序列认定为启动子序列。利用PlantCARE在线工具(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)进行启动子区顺式作用元件预测分析。

1.2.6 番茄CaM3、CaM4和CaM5基因在低温胁迫下的表达模式及组织表达分析 根据SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因的cDNA序列,避开保守片段,在各自的特异性区域内设计qRT-PCR引物(表1),以1.2.1中所述材料的cDNA为模板,以番茄β-actin基因为内参进行qRT-PCR分析。反应体系(10 μL):2 × SYBR premix EX Taq(TaKaRa) 5 μL,正向引物(10 μmol/L) 0.5 μL,反向引物(10 μmol/L) 0.5 μL,模板cDNA(100 ng/μL)1 μL,加ddH2O补至10 μL。反应程序:95 ℃ 预变性30 s;95 ℃ 变性5 s,60 ℃ 退火30 s,45个循环;95 ℃ 变性30 s,60 ℃ 退火1 min,95 ℃ 变性15 s。每种材料设置3次生物学重复,每个样品设置3次技术重复,最终结果采用2-ΔΔCT法计算分析,其中,以各基因在0 h,即尚未进行胁迫处理时的表达量为对照,设为“1”[16]。使用SPSS 20.0进行显著性分析。

于番茄功能基因组数据库(http://ted.bti.cornell.edu/cgi-bin/TFGD/digital/home.cgi)中下载番茄栽培种Heinz1706不同组织的RNA-seq测序数据(D004),提取SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因在Heinz1706不同组织中的表达数据,导入MeV软件,生成表达热图。

2 结果与分析

2.1 番茄CaM3、CaM4和CaM5基因的克隆

以番茄栽培种Heinz1706幼苗叶片组织的cDNA为模板,分别扩增SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因的CDS序列,产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测,发现3次扩增反应均产生一条接近500 bp的特异性条带。回收测序分析表明,三者长度均为450 bp,具有连续完整的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF),编码149个氨基酸。核酸序列比对(图1)发现3条序列仅有较小差异,相似度为93.63%,而其编码的氨基酸序列完全相同。

图1 SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因序列比对Fig.1 Sequence multi-alignment of SlCaM3,SlCaM4 and SlCaM5

2.2 氨基酸序列分析

对SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因所编码的相同的蛋白序列进行理化性质分析,发现其蛋白长度为149个氨基酸,分子式为C721H1133N189O254S10,相对分子质量为16.83 ku;由20种氨基酸组成,其中酸性氨基酸Asp和Glu的含量最多,分别为13.4%和12.1%,碱性氨基酸(Arg和Lys)占10.06%,理论等电点4.1,为酸性蛋白;不稳定系数24.43,为稳定蛋白;亲疏水性分析结果显示,该蛋白的平均疏水指数为-0.619,为亲水性蛋白。二级结构预测结果显示,该蛋白由60.4%的α-螺旋、9.4%的β-折叠、6.04%的延伸链和24.16%的无规则卷曲组成;三级结构预测结果显示(图 2-A),该蛋白由较多α-螺旋构成了类似骨棒状结构,中间由较长的α-螺旋连接,棒状结构两端分别含有2个钙离子;对该蛋白结构域分析发现(图 2-B),该蛋白属于PTZ00184家族,即CaM蛋白家族,另含有4个EF-h domain(钙离子结合结构域),与三级结构预测结果一致。

A.番茄CaM蛋白的三级结构预测;B.番茄CaM蛋白的保守结构域分析。A.Predicted tertiary structure of CaM protein of tomato;B.Conservative domain of CaM protein of tomato.图2 番茄CaM蛋白的三级结构预测和保守结构域分析Fig.2 Predicted tertiarystructure and conservative domain of CaM protein of tomato

2.3 番茄CaM3、CaM4和CaM5基因启动子区顺式作用元件分析

为解析SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因的表达模式,分别对3个基因的启动子区顺式作用元件进行分析。结果显示,3个基因的启动子序列含有多种胁迫响应和激素信号响应的顺势元件(表 2),表明SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因虽然编码同一个蛋白质,但各自的表达模式受到内外多因素的共同调控。3个基因各自的启动子区除含有真核生物所必需的核心元件CAAT-box和TATA-box外,还含有如光信号响应元件:G-box、GT1-motif和MRE;激素类信号应答元件:ABRE(脱落酸信号响应元件)、CGTCA-motif(茉莉酸信号响应元件)、P-box(赤霉素信号响应元件)、TATC-box(赤霉素信号响应元件)、TCA-element(水杨酸信号响应元件)、TGA-element(生长素信号响应元件)和TGACG-motif(茉莉酸信号响应元件);胁迫响应元件:ARE(缺氧信号响应元件)、LTR(低温信号响应元件)、MBS(干旱信号响应元件)和TC-rich repeats(防御和胁迫信号响应元件);另外在SlCaM3和SlCaM4基因的启动子区还鉴定到CAT-box(分生组织特异性表达元件),推测SlCaM3和SlCaM4可能在分生组织中特异性表达并发挥作用。进一步分析发现,SlCaM3基因启动子区所含顺式作用元件的类型最为丰富,表明该基因在激素响应和抵御非生物胁迫等活动发挥着重要作用。横向对比3个番茄CaM基因的顺式元件分布情况发现,多数元件呈互补模式分布,预示着CaM蛋白功能的多样性。

表2 SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5的启动子序列顺式作用元件分析Tab.2 Putative cis-element analysis in promoter regions of SlCaM3,SlCaM4 and SlCaM5

2.4 番茄CaM3、CaM4和CaM5基因低温胁迫下的表达模式

本研究共设置2个处理组:15,5 ℃,利用qRT-PCR技术,以0 h(尚未进行胁迫处理)的叶片cDNA样品为对照,探究SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因在多个番茄品种幼苗叶片组织中受低温胁迫后一段连续时间内的表达情况。结果显示,15 ℃处理(图 3)时,番茄品种Heinz1706的叶片中SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5的表达在受胁迫2h内被抑制;4h之后表达量缓慢升高,其中SlCaM5基因表达上调较为明显,SlCaM3和SlCaM4基因恢复至原有水平;LA3969的叶片中,SlCaM4基因在受到低温刺激后0.25h内表达量降低,之后其表达缓慢升高,在4h时显示为上调;SlCaM3和SlCaM5基因在受到胁迫后表达量持续升高,4h后尤为明显,其中SlCaM5基因表达上调更为显著。SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因在冀粉2号、冀粉3号和农博粉霸15中的表达模式与在Heinz1706中的表达模式类似;纵观全局发现,SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因在5种番茄材料中的表达模式均呈现出先降低后升高的趋势,值得注意的是,SlCaM5基因处理后期表达量升高更为显著。

不同小写字母表示基因表达差异显著(P<0.05)。图4同。Different lowercase indicate significant different(P<0.05).The same as Fig.4.图3 15 ℃低温胁迫下SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因的表达模式Fig.3 Expression profiles of SlCaM3,SlCaM4 and SlCaM5 in response to 15 ℃ cold stress

5 ℃处理(图 4)时,SlCaM3基因在Hein1706z、LA3969、冀粉2号和冀粉3号叶片中的表达模式相似,其表达量虽有小幅度升高或降低,但总体水平与未进行低温处理时基本一致;SlCaM4基因在Heinz1706中受到低温胁迫后12 h内表达量无显著变化,24 h后开始缓慢升高,在LA3969、冀粉2号和冀粉3号中2 h内表达受到抑制,4 h表达升高恢复至原有水平,之后再次受到抑制,于24～48 h再次升高;SlCaM5基因在Heinz1706、LA3969、冀粉2号和冀粉3号中的表达模式相似,在低温处理前期其表达量变化不明显,处理后期表达量显著升高。在农博粉霸15中,SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因的表达量均为先升高后降低的情况,且同时在处理1 h出现上调峰值,之后表达量逐步降低,在24 h后3个基因的表达均受到抑制,同时形态观察显示植株生命活动受到威胁。

图4 5 ℃低温胁迫下SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因的表达模式Fig.4 Expression profiles of SlCaM3,SlCaM4 and SlCaM5 in response to 5 ℃ cold stress

上述结果显示SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因对低温较为敏感,在不同番茄品种中的表达模式不同,其中SlCaM5基因在受到不同程度的低温胁迫后,表达量变化更为明显,在多个耐寒品种中表达量呈上升趋势,推测该基因在番茄抵御低温过程中的高表达,在维持CaM蛋白的翻译水平中发挥着重要作用。

本研究参考番茄RNA-Seq数据,分析了SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因在栽培品种Heinz1706的不同组织及果实发育阶段中的特异性表达模式。结果表明(图 5),Heinz1706品种SlCaM3和SlCaM4在分生组织活跃的花、根和果实发育初期中具有较高的表达,而在叶和成熟果实中的表达水平较低;在启动子顺式元件分析结果中,SlCaM3和SlCaM4基因均含有分生组织特异性表达元件,结果相一致。SlCaM5基因在Heinz1706的不同组织中表达水平差异不明显。

1.花蕾;2.花;3.叶片;4.根;5.1 cm 果实;6.2 cm 果实;7.3 cm 果实;8.绿熟期果实;9.转色期果实;10.转色10 d果实。1.Flower buds;2.Flowers;3.Leaves;4.Roots;5.1 cm fruits;6.2 cm fruits;7.3 cm fruits;8.Mature green fruits;9.Breaker fruits;10.Breaker +10 d fruits.图5 SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因在Heinz1706不同组织中的表达模式Fig.5 Expression profiles of SlCaM3,SlCaM4 and SlCaM5 in different tissues of Heinz1706

3 结论与讨论

CaM在高等生物中具有高度保守性,能够承受很强的选择压力,在生物体中发挥着重要的生物学功能[17]。本研究中克隆到的SlCaM3、SlCaM4和SlCaM53条序列相似度为93.63%,编码的149个氨基酸序列完全相同,并且具有CaM蛋白家族典型EF-h domain。CaM是一类广谱型信号分子,其功能也具有广泛性以适应复杂的生长环境,但不同的CaM基因在响应环境胁迫和激素信号时具有不同的分工[18]。本研究对3个基因的启动子区顺式元件分析发现,尽管SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因虽然编码同一个蛋白质,但启动子序列含有多种顺势元件响应多种非生物胁迫和激素信号,说明各自的表达模式受到内外多种不同因素的调控,在多种逆境胁迫下保证CaM蛋白功能不受影响。在SlCaM3和SlCaM4基因的启动子区还鉴定到分生组织特异性表达元件,这与组织特性表达结果相互印证,表明启动子区域复杂性,同时提示了作用元件的重要性。横向对比顺式元件分布,呈互补模式分布,提示基因家族或可能存在联动调控的机制。

植物感受低温信号并传递信号到细胞核内,激活转录因子,进而调节基因表达,引起一系列生理生化反应,产生抗寒能力,这是一个复杂的信号系统[19]。在低温信号转导途径中,Ca2+是重要的第二信使[20-22]。低温胁迫发生时,Ca2+浓度发生变化,Ca2+与受体蛋白CaM结合后进一步激活下游钙依赖的蛋白激酶(CaMK)或CaM结合蛋白(CaMBP)[23-24],蛋白激酶的活化导致与活性氧代谢相关的POD、SOD、CAT等活性增强或转录因子激活,从而完成信号转导,参与胁迫应答[25-26]。大量研究表明,CaM蛋白可以通过钙离子信号途径来提高植物对低温胁迫的耐受性。沙冬青AmCaM1在低温处理下1 h表达量开始上调[27]。茶树CsCaM1和CsCaM2在低温胁迫(4 ℃)下表达量均升高,其中CsCaM2受低温影响的诱导程度更大[28]。本研究中SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5在5个番茄栽培品种受低温胁迫时表达量均有所变化,15 ℃下这3个基因在所有番茄品种中表达量均呈上调趋势,其中SlCaM5对低温的响应更为迅速(LA3969、农博粉霸15),并且在5个品种中表达量变化更为明显。5 ℃时这3个基因的表达情况更为复杂,在Heinz1706、LA3696、冀粉2号和冀粉3号4个品种中,SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5表达量均表现为上调趋势,但对低温胁迫时间的响应不尽相同;然而在农博粉霸15中,这3个基因表达量先升高,并于低温胁迫1 h后达最高表达量,然后下降。SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5在不同番茄品种中对不同程度低温以及胁迫时间有不同的响应模式,表明其参与了番茄抵御低温过程,并在其中发挥着重要的调控作用。

CaM蛋白在植物中的表达具有器官差异性。油茶CoCaM1在花芽到子房形成中的表达量较高;而CoCaM2在果实发育以及油脂积累过程中的表达量较高[29]。鸭梨PbCaM1和PbCaM2在成叶、盛花期花瓣和幼果期表达量较高[30]。百脉根LjCaM3在根及根瘤中的相对表达量显著高于茎、叶、花和豆荚[31]。本研究中,SlCaM5基因在Heinz1706的不同组织中表达水平差异不明显,而SlCaM3和SlCaM4在分生组织活跃的花、根和果实发育初期中具有较高的表达,而在叶和成熟果实中的表达水平较低。这表明它们在花、果实形成以及根的发育过程中发挥着不同的调控作用,同时也提示了基因调控的多样性。

克隆获得了番茄SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因,三者编码相同的蛋白序列,启动子区域含有多种响应生物及非生物胁迫的顺式作用元件。SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因在番茄不同组织中表达差异性明显,在不同番茄品种中对低温胁迫较为敏感,预示着番茄CaM基因可能在番茄抵御低温过程中发挥着作用。