胃癌组织中趋化素样因子超家族8蛋白表达与胃癌上皮-间质转化关系及临床意义

闫 萌,张 征,邢保健,张 鹏,李润婷,朱小年

(1.保定市第一中心医院普通外三科,河北 保定 071000;2.保定市第二医院妇科,河北 保定 071000;3.桂林医学院公共卫生学院流行病学与统计学系,广西 桂林 541000)

胃癌(Gastric carcinoma,GC)是消化系统最常见恶性肿瘤之一,是全球第五大常见恶性肿瘤和第三大癌症相关死亡原因,病死率位居首位。手术是目前临床根治胃癌的唯一方法,其可通过对肿瘤组织及其邻近受到肿瘤细胞侵袭的组织进行切除,进而实现对肿瘤细胞及组织的清除[1-2]。尽管其综合治疗的效果显著提高,但胃癌的高侵袭转移特点导致患者的临床治愈率和长期生存率仍然很低。上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)是一种细胞生物学过程,其中上皮细胞通过特定程序下调上皮特征后获得间充质表型[3-4]。EMT与恶性肿瘤发生进展关系密切,为开发潜在的治疗靶点提供思路。E-cadherin、Vimentin和N-cadherin 是较为常用的EMT 相关基因。E-cadherin参与同型细胞间的黏附连接,在维持细胞形态及极性中具有重要作用,是一种经典的上皮细胞标志物;Vimentin是细胞骨架蛋白中的一种,广泛分布于各种内皮细胞、成纤维细胞等间质细胞中,在维持间质细胞形态、调节细胞黏附分子中起到重要作用;N-cadherin蛋白表达可促进肿瘤的浸润与转移[5]。趋化素样因子超家族8(CKLF-like MARVEL transmembrane domain containing,CMTM8)作为含有 MARVEL 跨膜结构域的趋化素样因子超家族成员[6],在包括肝脏、肺、结直肠、胃、食管等多种实体瘤中表达下调[7],并参与肿瘤的侵袭转移过程。最新研究[8-9]表明,CMTM8通过激活Wnt-β-catenin信号通路,诱导肿瘤EMT过程。而CMTM8与胃癌EMT表型的关系尚未见报道,本研究通过分析CMTM8与EMT在胃癌组织中的表达,进而探讨CMTM8与EMT之间的关系及临床意义。

1 对象与方法

1.1 研究对象 收集78例保定市第一中心医院2014年1月至2020年5月通过病理确诊为胃癌患者的胃癌组织和相应癌旁5 cm以上的正常胃黏膜组织。所有患者术前均未接受任何放疗或化疗。从患者病历中收集完整临床信息,并记录自手术日期到死亡日期或最后一次随访的生存时间。病例纳入标准:符合《胃癌规范化诊疗指南(试行)》中诊断表标准[10];有完整的临床资料;排除标准:合并肾间质、肝、肺纤维化者;有并发其他肿瘤者;心、肾功能不全者。本研究通过保定市第一中心医院伦理委员会的批准。

1.2 试 剂 CMTM8兔抗人多克隆抗体购自Proteintech公司(15039-1-AP),E-cadherin、Vimentin和 N-cadherin兔抗人多克隆抗体均购自北京博奥森生物公司; 免疫组化检测试剂盒、DAB 显色剂及 GAPDH 鼠抗人单克隆抗体均购自北京中杉金桥公司。

1.3 免疫组化法检测CMTM8在胃癌与癌旁正常组织中的表达 胃组织蜡块标本制成5 μm厚的组织切片,采用免疫组化染色间接染色法按试剂盒说明书进行免疫组化染色。一抗包括CMTM8(1∶150),E-cadherin(1∶300),Vimentin(1∶300),N-cadherin(1∶300)。结果判定:为了评估CMTM8表达,随机选择每个标本中的5个区域,并在显微镜下计数>500个细胞,以确定免疫染色细胞的平均百分比。按阳性细胞染色百分比划分为5个等级:无阳性细胞为0分,阳性细胞数占6%～25%为1分,26%～50%为2分,51%～75%为3分,大于75%为4分。根据染色强度划分为4个等级:无染色为0分,淡黄色为1分,黄色为2分,棕黄色为3分。最后将两项得分相加之和作为CMTM8最终染色得分:>4分定为CMTM8阳性,≤4分定为CMTM8阴性。E-cadherin>50%的细胞呈棕黄色为阳性; Vimentin>10%的细胞呈棕黄色颗粒为阳性;N-cadherin>10%的细胞呈棕黄色为阳性。

1.4 Western blot法检测CMTM8、EMT标志蛋白在胃癌与癌旁正常组织中的表达 在新鲜的胃癌组织中加入RIPA裂解液后提取组织中的总蛋白,采用 BCA 法测定组织样品中的蛋白表达。将总蛋白置于10%的SDS-PAGE中进行电泳,分离的蛋白质转移至PVDF膜后以5% 脱脂奶粉室温封闭1 h,分别孵育一抗 CMTM8(1∶1000),4 ℃过夜。次日以相应的辣根过氧化物酶标记的二抗 ( 1∶1500) 室温孵育 2 h,用 ECL 发光并拍照。结果用 Image J 软件进行条带灰度值测定,以与内参GAPDH( 1∶1500) 的比值作为各指标的相对表达量。

1.5 统计学方法 采用SPSS 25.0统计学软件进行统计学分析。计数资料以例数表示,采用χ2检验;用Pearson相关检验CMTM8蛋白表达水平与胃癌患者临床病理特征之间以及EMT标志蛋白之间的相关性;采用Kaplan-Meier法进行生存分析;P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 CMTM8蛋白表达与胃癌患者临床病理特征的关系 Pearson相关检验表明,患者的性别、年龄、家族史、肿瘤直径、糖链抗原199(CA199)、血清癌胚抗原(CEA)、浆膜侵犯、淋巴结转移与CMTM8表达无相关性(r=0.071、3.375、1.012、1.928、0.002、0.238、0.347、0.039,P=0.790、0.066、0.314、0.165、0.964、0.626、0.556、0.843),患者的疾病分化程度、TNM分期、发生远处转移与CMTM表达呈正相关(r=4.136、5.285、5.309,P=0.042、0.022、0.021);胃癌组织中E-cadherin、Vimentin和N-cadherin的阳性率分别为:30.8%、34.6%和61.5%;CMTM8与E-cadherin表达呈正相关(r=0.242,P=0.006),与Vimentin和N-cadherin表达呈负相关(r=-0.285、-0.332,P=0.002、0.026)。见表1。

表1 CMTM8表达与胃癌患者临床病理特征的关系(例)

2.2 CMTM8在胃癌和癌旁正常黏膜组织中的表达比较 免疫组化结果显示,CMTM8主要定位于细胞膜和细胞质中(图1)。胃癌组织中CMTM8的阳性率(29.49%,23/78),明显低于癌旁正常黏膜组织(61.54%,48/78)(P<0.01),见表2。

图1 CMTM8在胃癌和癌旁正常黏膜组织中的表达(免疫组化染色,×400)

表2 CMTM8在胃癌和癌旁正常黏膜组织中的表达(例)

2.3 CMTM8与EMT标志蛋白在胃癌组织和正常黏膜组织中的表达比较 胃癌组织中,CMTM8蛋白和E-cadherin蛋白表达水平低于癌旁正常黏膜组织,差异有统计学意义(均P<0.05);胃癌组织中Vimentin、N-cadherin蛋白表达水平高于癌旁正常黏膜组织,差异有统计学意义(均P<0.05)。见图2。

A:CMTM8蛋白表达情况;B:E-cadherin蛋白表达情况;C:Vimentin蛋白表达情况;D:N-cadherin蛋白表达情况;与癌旁正常黏膜组织比较,*P<0.05

2.4 CMTM8蛋白表达与胃癌患者预后的关系 根据免疫组化结果,将78例胃癌患者分为阳性表达组和阴性表达组,以探讨其与预后的关系。CMTM8阳性表达和阴性表达的胃癌患者中位生存时间分别为61个月(95%CI:50.80～71.55)、41个月(95%CI:33.28～49.60),对数秩检验后发现,CMTM8阴性表达组胃癌患者预后差于阳性表达组胃癌患者(P<0.05)。

3 讨 论

在肿瘤细胞中,EMT的发生往往导致细胞恶性生物学行为增强,EMT过程使正常细胞和癌细胞之间失去细胞间连接、上皮与基质间黏附、正常上皮细胞极性,从而获得间质细胞特性[11]。而胃癌发生侵袭转移与胃癌细胞发生EMT密切相关。其特点是上皮标记物E-cadherin表达下调,间质标记物Vimentin、N-cadherin表达上调[12]。因此,对EMT相关分子的研究将可能对胃癌的治疗及改善预后起到重要作用。

CMTM8是新近发现的新型人类趋化性细胞因子,其表达产物为4次跨膜蛋白并具有MARVEL结构域,其过表达可通过减弱EGFR介导的信号传导,加速EGFR从细胞表面的内化,进而影响细胞增殖[13]。CMTM8及其剪接变异体CMTM-V2(缺少由外显子2编码的MARVEL结构域和细胞质的YXX基序)通过半胱天冬依赖和非依赖的途径诱导多个肿瘤细胞系凋亡[14]。

CMTM8在肿瘤中的作用使其成为近年来的研究热点。先前的研究[15-17]已经发现,CMTM8在卵巢癌和脑转移性三阴乳腺癌中低表达,并且在骨肉瘤中确定为新的候选抑癌基因。在膀胱癌中,低表达的CMTM8与较晚的TNM分期和肿瘤分级相关,提示预后不良,而过表达的CMTM8可抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭[18-19]。本课题结果表明,CMTM8在胃癌中的表达低于癌旁正常胃黏膜组织,并与胃癌患者的分化程度、TNM分期和远处转移显著相关,且有远处转移的胃癌组中CMTM8蛋白表达水平低于无远处转移组。此外,我们还发现低表达的CMTM8提示胃癌患者预后不良。胡浩等[20]报道,CMTM8在低级别肾透明细胞癌的细胞膜上表达强度明显下降,在高级别肾透明细胞癌的细胞膜上表达强度进一步减弱,同时其肺转移及骨转移组织中细胞膜表达水平持续下降,提示CMTM8与肾透明细胞癌的进展和转移呈显著负相关。以上研究结果与本组实验结果相一致,提示CMTM8表达下降可能对胃癌的发生和转移有促进作用。既往文献[21]报道,上调的CMTM8可以通过HGF/c-MET/ERK信号传导通路抑制ERK-MAPK通路的激活,从而抑制HepG2肝癌细胞的EMT过程,进而使肝癌细胞迁移、侵袭能力减弱。Shi等[8]报道,CMTM8与溶血磷脂酸(LPA)之间的相互作用导致Wnt-β-catenin信号传导通路的激活,并因此诱导胰腺癌的EMT过程,这使CMTM8被认为是LPA诱导胰腺癌侵袭的关键因素。在一项结肠癌的研究中发现,CMTM8与上皮相关标志物TJP1呈负相关,与间充质相关标志物如MMP3、MMP7、MMP9呈正相关[22]。

综上所述:本研究在胃癌组织水平研究了CMTM8表达与EMT标志蛋白表达的关系,结果表明:CMTM8与E-cadherin表达呈正相关,与Vimentin和N-cadherin表达呈负相关;进一步Western blot检测发现,CMTM8高表达的胃癌组织中,E-cadherin同样高表达,而Vimentin和N-cadherin低表达,反之亦然,这表明CMTM8参与胃癌的EMT过程,其低表达促进了胃癌的侵袭转移。值得注意的是,本研究虽然与其在结肠癌中的结果不一致,但这充分说明了CMTM8乃至其家族功能的复杂性,可能对不同类型肿瘤细胞产生积极或消极的影响。有关CMTM8的研究尚处于起步阶段,探讨其与胃癌EMT的关系有助于揭示胃癌的发生、发展机制,使其有望成为胃癌诊断和治疗的潜在靶点。