微小RNA-195通过靶向抑制PH结构域富亮氨酸重复蛋白磷酸酶2表达参与香烟烟雾诱导急性肺损伤机制研究

梁艳均,吴桂全,漆 勇,李 静

(川北医学院附属三台医院 三台县人民医院,四川 三台 621100)

随着近些年我国环境污染的加重,各类呼吸系统疾病的发病率呈现逐年递增趋势,慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一类以气流阻塞为典型症状的疾病,患者主要临床表现为以气流阻塞为特征的气管炎症和肺气肿,如未得到及时干预可能会发展为肺心病或呼吸衰竭,COPD具有较高的致残率和病死率,全球40岁以上发病率现已高达9%～10%[1-3]。研究[4]指出,COPD的发病机制尚不清晰,但该病的发生与多种因素有关,吸烟、空气污染、病毒感染、基因多态性、性别、年龄等均与该病的发生存在密切联系。研究[5]指出,吸入香烟烟雾是导致COPD的最主要因素之一。临床实践发现,香烟烟雾会诱导炎症发生并直接导致肺组织的损害,对COPD发病机制的探究对针对性制订防治策略具有重要意义。微小RNA(microRNA,miRNA)是一类长约18～22个核苷酸的小分子非编码RNA,此类RNA能够通过靶向与某些位点的结合,对靶蛋白的表达产生影响,进而干预细胞生长、分化、凋亡、能量代谢等生理功能[6]。miR-195目前发现在乳腺癌、肝癌、结直肠癌等多种病变中呈现高表达态[7]。本研究通过探究miR-195靶向抑制PH结构域富亮氨酸重复蛋白磷酸酶2(PH domain leucineme-rich repeat protein phosphatase 2,PHLPP2)参与香烟烟雾诱导急性肺损伤的机制,现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料 ①实验动物:选择健康清洁级小鼠90只,体重20～26 g,平均(22.36±2.01)g,购自北京隆安实验动物养殖中心,许可证号SYXK(京)2014-0040。所有动物均于21～24 ℃的光照-暗循环12 h条件下实施标准化喂养,本次实验所有操作和流程均符合《实验动物管理条例》。②其他材料:小鼠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-8(IL-8)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、髓过氧化物酶(MPO)、超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽(GSH)ELISA试剂盒均购自上海酶联生物科技有限公司(批号ml002095、ml063162、ml037717、ml002070、ml643059、ml643115)。光学显微镜购自日本奥林巴斯(型号BX53P)。

1.2 研究方法 将所有小鼠随机分为A、B、C三组,每组各30只。将A组小鼠作为正常对照组,B组小鼠作为低剂量干预组,C组小鼠作为高剂量干预组。对B、C两组小鼠依据以往报道的方法[8]建立香烟烟雾诱导的急性肺损伤小鼠模型,其中B组小鼠暴露于5支香烟烟雾条件下,4次/d,每次间隔30 min不吸烟,5 d/周,共干预15周;C组小鼠暴露于10支香烟烟雾条件下,4次/d,每次间隔30 min不吸烟,5 d/周,共干预15周;当两组小鼠肺部出现炎性反应,且病理检查发现渗出性肺水肿则说明建模成功。A组小鼠不实施任何干预,暴露于常规空气环境中。

1.3 观测指标及评估标准

1.3.1 小鼠肺泡灌洗液炎症细胞因子水平检测:于末次暴露于香烟烟雾后18 h处死小鼠,分离其气道进行插管,结扎左肺并实施肺泡灌注,取灌注液采用酶联免疫吸附法(ELISA法)检测灌注液中 TNF-α、IL-8及MMP-9水平,注意操作严格按照试剂盒说明书进行,每个指标检测3次,取平均值作最终值。

1.3.2 小鼠肺泡灌注液炎症细胞计数:取50 μl肺泡灌注液加入同等体积的白细胞计数液,于100倍光镜下进行白细胞计数观察,同时取肺泡灌注液离心后留沉淀做细胞涂片,室温下干燥后染色,400倍光镜下观察细胞分类计数。

1.3.3 小鼠肺泡灌注液过氧化物质水平检测:取三组小鼠肺组织,制作成为5%的肺匀浆,使用试剂盒检测上层清液中MPO、SOD、GSH水平,并进行组间对比。

1.3.4 小鼠肺组织miR-195及PHLPP2蛋白表达检测:取三组小鼠肺组织匀浆,提取总RNA后逆转录为cDNA后采用RT-PCR的方法测定肺匀浆中miR-195表达情况;选择小鼠肺组织于-80 ℃条件下冰冻,取出后在液氮中研磨为粉末状,加入裂解液制备组织匀浆,而后使用Westtern blot法检测PHLPP2蛋白表达量,并进行组间对比。

2 结 果

2.1 三组小鼠肺泡灌洗液炎症细胞因子水平对比 C组TNF-α、IL-8及MMP-9水平均高于B组,B组均高于A组,同时组间对比差异具有统计学意义(均P<0.05),见表1。

表1 三组小鼠肺泡灌洗液炎症细胞因子水平对比

2.2 三组小鼠肺泡灌注液炎症细胞计数对比 C组白细胞、中性粒细胞均高于B组,B组均高于A组,组间对比差异具有统计学意义(均P<0.05),见表2。

表2 三组小鼠肺泡灌注液炎症细胞计数对比(102/mm3)

2.3 三组小鼠肺泡灌洗液过氧化标志物水平对比 C组MPO、SOD、GSH水平高于B组,B组高于A组,组间对比差异具有统计学意义(均P<0.05),见表3。

表3 三组小鼠肺泡灌洗液过氧化标志物水平对比

2.4 三组小鼠肺组织miR-195及PHLPP2蛋白表达量对比 miR-195表达C组>B组>A组,PHLPP2蛋白表达C组

表4 三组小鼠肺组织miR-195及PHLPP2蛋白表达量对比

3 讨 论

COPD是一种不完全可逆的以气流受限为典型临床特征的疾病,患者的气流受限常呈进行性发展,具体可分为慢性支气管炎和肺气肿两种疾病。流调学显示,COPD居目前全球发病率第12位和死因第4位,有学者预计到2020年,COPD将成为仅次于冠心病和心脑血管疾病的第5位致残和第3位致死疾病[9]。资料[10]表明,在美国COPD位居第4位致死原因,在欧盟居第3位,在我国COPD居第4位。据世界卫生组织(WHO)一项调研显示,全球COPD患病率约为0.8%,临床实践指出,COPD危险因素包括吸烟、空气污染、营养、遗传等,在上述因素中,吸烟被认为是COPD最危险因素,约有10%～15%的人会罹患COPD,因而对吸烟如何诱导肺损伤机制的探究是改善COPD患者生活质量的重要途径之一[11]。

随着近些年分子生物技术的发展,miRNA在肿瘤及其他疾病中所发挥的作用逐渐被发掘出来,对miRNA的研究成为探究肿瘤发生发展、侵袭、转移、治疗等进程的重要手段。miR-195位于17号染色体长臂上,在以往的研究中,有多项研究证实该基因与多种癌症进程存在密切联系。张文昭等[12]通过将54例早期乳腺癌患者、58例良性乳腺癌患者及70例健康女性进行对比分析发现,早期乳腺癌患者血清中miR-195表达量明显高于良性乳腺疾病组及健康对照组女性,同时经工作特征曲线分析显示,miR-195岁早期乳腺癌诊断敏感度为70.0%,特异度为93.3%;王依等[13]则通过体外培养的方式发现,miR-195对肺癌细胞株A549的生长、凋亡及迁移等生物学行为产生影响,分析其原因为miR-195能够通过靶向调控MYB基因来抑制A549细胞株的生长和迁移,促进其凋亡。PHLPP目前被发现能够通过使Akt、蛋白激酶C及S6激酶相应保守位点去磷酸化来促进细胞凋亡并抑制细胞增殖,PHLPP2是PHLPP的一类。何晓燕等[14]通过将40例食管上皮内瘤变与63例食管鳞癌患者进行对比分析发现,良性病变患者组织中PHLPP2表达水平明显高于食管鳞癌患者,而良性病变患者与正常对照组组织中水平对比差异并不明显,进一步分析显示PHLPP2还与食管鳞癌患者TNM分期有密切相关性,提示该蛋白可以作为食管鳞癌诊断指标之一。

本研究通过动物实验的方式,就miR-195通过靶向PHLPP2来参与香烟烟雾诱导肺损伤进程进行了探究,结果显示,使用香烟烟雾进行干预的B组及C组小鼠其肺组织中炎症因子TNF-α、IL-8及MMP-9水平明显高于空气干预的A组小鼠,同时B、C两组小鼠其白细胞和中性粒细胞计数也明显升高,MPO、SOD、GSH等过氧化物指标水平也有提升,分析认为,烟雾诱导会导致小鼠肺组织出现急性炎性反应,其机制为烟雾能够激活上皮细胞和巨噬细胞使其释放趋化因子从而吸引炎症细胞进入肺部[15-17]。最后本研究结果还提示,B、C两组小鼠其肺组织中miR-195表达量明显高于A组小鼠,PHLPP2表达量明显低于A组小鼠,分析认为,PHLPP2能够通过去磷酸化使Akt失活,从而抑制细胞的凋亡,本研究中PHLPP2属于miR-195的靶点,miR-195的过表达能够下调PHLPP2的水平,进而提高了Akt在细胞中的磷酸化水平,通过正调控Akt磷酸化,从而加快肺泡细胞的凋亡,加重肺组织的炎性反应和损伤进程[18-20]。

综上所述,香烟烟雾能够诱导小鼠肺组织出现炎性改变,分析其原因与miR-195过表达并抑制PHLPP2蛋白表达有关。