Periostin调控AKT信号通路激活胃癌细胞的上皮间质转化

金良玉,耿志军,张小凤,宋 雪,李 静

胃癌是消化系统最常见的恶性肿瘤,是全球第三大癌症死亡原因[1]。我国癌症报告显示,胃癌位居我们恶性肿瘤发病率和死亡率的第2位,仅次于肺癌,造成了巨大的经济以及公共卫生负担[2]。Periostin(POSTN)为成骨细胞特异性因子2[3]。研究[4]发现POSTN参与细胞黏附、结缔组织的发育、细胞存活、血管形成、组织修复和再生。且POSTN在乳腺癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌和卵巢癌等癌症中过表达[5]。上皮间质转化(EMT)在癌细胞的增殖、浸润和远处转移过程中发挥重要作用[6],以及蛋白激酶B(AKT)信号通路在胃癌的癌变和细胞生存控制过程中的发挥着重要作用[7]。本研究探讨了POSTN调控AKT信号通路激活胃癌细胞EMT的机制。现作报道。

1 材料与方法

1.1 材料 人胃组织收集于蚌埠医学院第一附属医院普外科,并已获得病人的知情同意。人胃癌细胞MGC 803(购自北京协和细胞库)、RPMI-1640培养基和胎牛血清(美国Gibco公司)、过表达和敲除POSTN基因的慢病毒(吉凯基因)、Trizol(美国Invitrogen公司)、PCR引物(上海生工生物工程股份有限公司)、SYBR Green PCR Master Mix和RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒(北京天根生化科技有限公司)、MTT试剂和结晶紫染料(北京索莱宝生物科技有限公司)、Transwell小室(美国corning公司)。

1.2 方法

1.2.1 免疫荧光 将胃癌组织置于4%多聚甲醛固定、脱水机脱水、石蜡包埋、制片、烤片和抗原修复后,孵育POSTN(stanta cruz biotechnology,1∶100)和CD44(abcam,1∶200),洗涤3次后,孵育Alexa Fluor®594标记兔抗山羊IgG(H+L)和FITC标记山羊抗小鼠IgG(H+L)(北京中杉金桥生物有限公司,1∶200),洗涤后滴加DAPI(thermo)对细胞核进行染色,置于激光共聚焦显微镜(Leica,SP8)采集图片。

1.2.2 细胞培养 将MGC 803细胞移入含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中,置于含有5% CO2、37 ℃的培养箱中培养。

1.2.3 细胞转染 将MGC 803细胞种植于6孔板中,提前1 h换新鲜的培养,分别滴加过表达和敲除POSTN基因的慢病毒溶液,置于培养箱中培养6 h,更换新鲜的培养基。培养3 d后,更换含有5 μg/mL嘌呤霉素的完全培养基进行阳性细胞筛选,收集各组细胞进行后续实验。

1.2.4 抑制剂的孵育 将细胞种植6孔板中,更换新鲜的无血清RPMI-1640培养基置于培养箱中培养24 h,更换含有LY294002(sigma,10 μmol/L)的无血清RPMI-1640培养基于培养箱中培养24 h,用于后续实验。

1.2.5 RT-qPCR 采用Trizol法提取MGC 803、过表达POSTN基因的MGC 803和敲除POSTN基因的MGC 803以及添加LY294002抑制剂的胃癌细胞,按照PCR说明书进行PCR实验。GAPDH作为内参,所用的引物序列见表1。

1.2.6 Western blotting 采用RAPI裂解液提取胃癌细胞,经BCA蛋白定量、loading buffer稀释和煮沸变性后经SDS-PAGE电泳与转膜后,孵育POSTN(1∶1 000)、CD44(1∶1 000)、α-sma(CST,1∶1 000)、VIM(CST,1∶1 000)、snail+slug(CST,1∶1 000)、E-cad(CST,1∶1 000)和GAPDH(CST,1∶1 000),在经过氧化物酶连接的二抗(北京中杉金桥生物有限公司,1∶2 000)孵育,经暗室曝光并采集图片。

1.2.7 CCK-8 将胃癌细胞种植于96孔板中,每孔1×103个细胞,置于培养箱中培养24 h,每孔加入10 μL的CCK-8试剂,培养箱中进行培养4 h,在490 nm下经酶标仪检测吸光度(OD)值。

1.2.8 Transwell迁移 消化稀释胃癌细胞,用无血清的RPMI-1640培养基重悬细胞,取4×104/mL的细胞100 μL种植于Transwell小室中,在24孔板中加入1 mL的完全培养,并种植好细胞的Transwell小室置于24孔板中,培养24 h后,再经多聚甲醛固定和结晶紫染色后,再显微镜下随机选取5个视野采集图片并统计分析。侵袭:冰上完全溶解Matrigel基质胶,取40 μL加入预冷的Transwell小室中;其余的操作步骤同迁移实验。

1.3 统计学方法 采用方差分析和q检验。

2 结果

2.1 POSTN在胃癌病人的癌旁、原发灶和转移灶组织中表达水平比较 与癌旁组织相比,原发灶和转移灶组织中POSTN的表达均明显地升高,以及转移灶组织中POSTN表达也明显高于原发灶组织,且POSTN的表达与CD44(肿瘤干性标志物)有共定位现象(见图1)。

2.2 POSTN在不同临床分期的胃癌原发灶组织中表达水平 免疫荧光显示胃癌原发灶组织临床分期越晚,POSTN的表达越高,且POSTN的表达与CD44也有共定位现象(见图2)。

2.3 过表达和敲除POSTN基因对MGC 803细胞的增殖、转移和侵袭的影响 与对照组相比,过表达POSTN基因MGC 803的细胞增殖活性、迁移和侵袭能力明显地升高;敲除POSTN基因MGC 803的细胞增殖活性、迁移和侵袭能力细胞明显地降低(P<0.01)(见图3和表2～4)。

2.4 过表达和敲除POSTN基因对MGC 803细胞EMT的影响 与对照组相比,过表达POSTN基因MGC 803的间质标志物(α-sma、VIM、snail和slug)的表达升高,上皮标注物E-Cadherin表达下降;而敲除POSTN基因MGC 803的间质标志物(α-sma、VIM、snail和slug)的表达下降,上皮标注物E-Cadherin表达升高(P<0.01)(见表5、图4)。

2.5 添加LY294002和过表达POSTN基因对MGC 803细胞的增殖、转移和侵袭的影响 分别与正常的和过表达POSTN基因的MGC 803相比,添加LY294002会明显地降低细胞的增殖、转移和侵袭能力(P<0.01)(见图5、表6)。

2.6 添加LY294002和过表达POSTN基因对MGC 803细胞EMT的影响 Western blotting和RT-qPCR显示,分别与正常的和过表达POSTN基因的MGC 803相比,添加LY294002会明显地降低间质标志物(α-sma、VIM、snail和slug)的表达,以及升高上皮标志物E-Cadherin的表达(P<0.01)(见图6、表7～9)。

表2 CCK8检测调控POSTN基因对MGC 803细胞增殖的影响

表3 调控POSTN基因对MGC 803细胞转移的影响

表4 调控POSTN基因对MGC 803细胞侵袭的影响

表5 RT-qPCR检测POSTN对MGC 803细胞EMT相关基因的影响

表6 CCK8检测LY294002对MGC 803细胞调控POSTN基因后增殖的影响

表7 LY294002对MGC 803细胞的调控POSTN基因后转移的影响

表8 LY294002对MGC 803细胞的调控POSTN基因后迁移的影响

表9 RT-qPCR检测LY294002抑制POSTN激活MGC 803细胞的

3 讨论

POSTN已被证实在各种转移性肿瘤的癌症基质中上调,例如肝细胞癌、肝内胆管癌、食道鳞状细胞癌、结肠癌、神经胶质瘤、乳腺癌、肺癌、黑素瘤、胰腺癌、卵巢癌、膀胱癌癌、头颈癌、甲状腺癌和前列腺癌[8]。POSTN被认为在肿瘤的发生、肿瘤细胞浸润性、肿瘤细胞转移性、血管生成、淋巴结血管生成、化疗耐药性和病人复发中均起着重要作用[9]。本研究进行了POSTN和CD44共同免疫荧光染色,以检测POSTN在胃癌转移灶组织、原发灶组织及其邻近正常组织中的表达。与邻近的正常组织相比,POSTN在原发灶和转移灶胃癌组织中的表达更高。对不同临床阶段胃癌病人的原发灶组织中的POSTN蛋白进行了免疫荧光染色,发现晚期胃癌病人的原发灶组织中POSTN的蛋白表达水平明显地高于早期。这些结果表明POSTN可能在胃癌的进展中起重要作用。

为了进一步验证POSTN在胃癌发生中的作用,我们对MGC 803进行过表达和敲除POSTN基因,发现过表达POSTN基因可以增强胃癌细胞的增殖活性,以及促进胃癌细胞的迁移和侵袭;并且敲除POSTN基因会降低胃癌细胞的增殖活性和减弱胃癌细胞的迁移和侵袭。这些实验结果表明POSTN促进了胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭,为胃癌提供了支持肿瘤生长以及促进胃癌细胞增殖和转移的微环境。

EMT是指上皮细胞失去根尖-基底极性和细胞间质黏附,转化为具有侵袭性间充质细胞的过程[10]。EMT在肿瘤的进展、转移和耐药性中发挥着重要作用[11]。本研究发现,与正常细胞相比,过表达POSTN会促进胃癌细胞间质标志物的表达和抑制上皮标志物的表达;以及敲除POSTN会抑制胃癌细胞间质标志物的表达和促进上皮标志物的表达。这些结果提示POSTN会促进胃癌细胞的EMT。然而POSTN如何影响EMT的,目前尚不清楚。另有研究[12]表明,AKT信号通路参与胃癌细胞增殖、肿瘤发生和预后,我们发现AKT抑制剂LY2940002明显缓解过表达POSTN导致的胃癌细胞增殖活性、迁移和侵袭能力,以及抑制胃癌细胞间质标志物的表达和促进上皮标志物的表达。这些结果表明POSTN可以经AKT信号通路调控胃癌细胞的EMT,进而促进胃癌细胞的增殖、转移和侵袭。

综上所述,POSTN不仅促进胃癌的转移,还加剧了癌症的行为。最重要的是,POSTN的高表达与晚期胃癌有关,POSTN的高表达水平是胃癌的危险因素之一。因此,POSTN可能是胃癌肿瘤浸润、转移和组织学分化的预测因子。这表明POSTN是恶性肿瘤及其转移的潜在治疗靶标。