枇杷清肺饮治疗痤疮的网络药理学作用机制研究

方如男，韩露，周扬，龙永香，李建红

（北京中医药大学东直门医院，北京 100700）

痤疮（Acne）是一种好发于青少年的毛囊皮脂腺的慢性炎症性皮肤疾病[1]。该病好发于面颊、额部、胸背部等皮脂腺发达的部位，以粉刺、炎性丘疹、脓疱、结节、囊肿、色素沉着及瘢痕为主要表现。痤疮的发病率高达85%[2]，其对皮肤和容貌的损害给患者的心理、工作、日常活动及人际关系带来很大的影响。痤疮的发病机制尚不完全明确，目前认为与内分泌紊乱、微生物感染、毛囊口角化过度、遗传、免疫炎性反应有关，此外也与精神因素、饮食习惯有关。

古代医家认为痤疮病位在肺，主受风、热外邪侵袭，当代医家也认为肺经风热证为痤疮的主要证型之一，枇杷清肺饮为治疗该证型的首选方。近年对枇杷清肺饮治疗痤疮的临床研究证实其疗效确切可靠[3]，但枇杷清肺饮治疗痤疮的活性成分及作用机制尚未完全阐明。

本研究通过网络药理学筛选出枇杷清肺饮的有效活性成分、作用靶标及有关信号通路，建立“药物-疾病-靶标-通路”的多层次网络，探究枇杷清肺饮治疗痤疮的作用机制，为后续研究提供思路和理论依据。

1 资料与方法

1.1 枇杷清肺饮的有效成分筛选及其作用靶点获取 使用TCMSP 数据库（https：//tcmspw.com/index.php），分别检索“枇杷叶”、“桑白皮”、“黄连”、“黄柏”、“人参”和“甘草”，根据该数据库提供的设置“药物口服生物利用度（OB）≥30%和药物相似度（DL）≥0.18”筛选出符合该条件的候选活性成分，并结合文献检索补充TCMSP 数据库筛选结果[4]。在TCMSP 数据库获取以上活性成分作用的蛋白质靶点，在Uniprot 蛋白质数据库（https：//www.uniprot.org）将靶点进行规范。

1.2 痤疮相关靶点的获取 以“acne”、“acne vulgaris”作为关键词，对GeneCards 数据库（https：//www.genecards.org）、OMIM 数据库（http：//www.omim.org）进行检索，获取痤疮相关潜在靶点。合并2 个数据库获得的痤疮潜在靶点，删除重复项得到痤疮的相关疾病靶点。

1.3 枇杷清肺饮成分-痤疮靶点蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络构建 使用R 语言（https：//www.r-project.org）将上述枇杷清肺饮有效成分的靶点与痤疮靶点取交集并绘制Venn 图。后将获得的交集靶点输入String11.0 数据库（https：//string-db.org/）限定物种为“Homo sapiens”，从而获得交集靶点相互作用的PPI 网络。利用Cytoscape 3.8.2 对PPI 网络进行拓扑分析，将Degree 值大于2 倍中位数的靶标作为关键靶点。

1.4 基因功能和通路富集分析 使用R 语言的“clusterProfiler”、“org.Hs.eg.db”、“enrichplot”、“ggplot2”等安装包对枇杷清肺饮和痤疮交集靶点进行基因本体功能富集分析（GO）、京都基因和基因组百科全书通路富集分析（KEGG）及可视化。

1.5 枇杷清肺饮“药物-活性成分-作用靶点-疾病”网络图的构建 根据上述所得到的枇杷清肺饮中的潜在活性成分与作用靶点与之间的关系，利用CytoScape 3.8.2 软件建立药物活性成分-作用靶点-疾病网络。

1.6 活性成分与核心靶点分子对接验证 在CytoScape 3.8.2 软件构建的网络图基础上，选择靶点数目最多的活性成分作为小分子配体，并通过PubChem 网站（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获取相应活性成分的分子结构。选取交集靶点PPI 网络图中“degree”值最大的靶点作为受体，在PDB 数据库（http：//www.rcsb.org/）获取其蛋白结构。使用AutoDock-Vina 软 件（http：//vina.scripps.edu/index.html）对活性成分与核心靶点进行分子对接验证，并使用PyMOL 软件（https：//pymol.org/2/）进行可视化处理。

2 结果

2.1 枇杷清肺饮活性成分及靶点的获取 共获取173 个活性成分，其中枇杷叶9 个，桑白皮22 个，黄连10 个，黄柏22 个，人参17 个和甘草82 个。另外通过文献检索发现枇杷叶的化学成分熊果酸有明显的抗炎作用[5]，苦杏仁苷有免疫抑制和抗炎作用[6]。因此将熊果酸、苦杏仁苷2 个活性成分纳入，最终获得175 个活性成分。基本信息见表1。根据所得175 个有效成分，使用TCMSP 数据库得到作用靶点并删去重复值获得有效成分对应的靶点328 个。

表1 枇杷清肺饮的活性成分信息

续表

2.2 痤疮疾病靶点的获取 从GeneCards 数据库获得痤疮靶点1 395 个，并结合补充14 个相关靶点，合并后删除重复值，最终得到1 407 个痤疮相关靶点。

2.3 枇杷清肺饮成分-痤疮靶点PPI 网络的构建将上述得到的药物活性成分与疾病靶点取交集，使用R 语言绘制Venn 图得到药物-疾病交集靶点127 个，见图1。将交集靶点输入String11.0 数据库，得到枇杷清肺饮靶点PPI 网络，PPI 网络共包含127个节点和2 389 条相互作用关系，利用2 倍DC 中位数，即DC≥68 筛选网络得到核心蛋白质相互作用网络，见图2，共有节点19 个，关键靶点信息见表2。

表2 关键靶点信息

图1 Venn 图

图2 PPI 网络图

2.4 GO 和KEGG 分析 GO 结果显示，枇杷清肺饮-痤疮-基因的生物过程（BP）显著富集在对脂多糖反应、对细菌微生物源反应、对营养水平的反应、类固醇代谢过程、对类固醇激素的反应等。细胞组分（CC）主要富集在NA 聚合酶Ⅱ转录因子复合物、核转录因子复合物、转录因子复合物、膜筏和膜微区等。KEGG 结果显示与痤疮相关的靶点主要富集在磷脂酰肌醇3-激酶/丝苏氨酸蛋白激酶（PI3K-Akt）信号通路、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路、肿瘤坏死因子信号通路等信号通路，提示枇杷清肺饮可能是通过上述通路起到治疗痤疮的作用。根据显著性程度P<0.05（P 值由小到大）排序，取前20 进行部分展示，见图3～5。

图3 GO-BP 富集分析

图4 GO-CC 富集分析

图5 KEGG 富集分析

2.5 枇杷清肺饮各有效成分-靶点-痤疮网络图的构建 运用CytoScape 3.8.2 构建“药物-活性成分-作用靶点-疾病”网络，见图6。其中各药之间存在重复活性成分，为方便分析，故对其进行编号A1～A13。图中共包含280 个节点（1 个疾病，6 味药材，146 个潜在活性成分，127 个作用靶点）和1 390 条边。每条边代表潜在活性成分与作用靶点之间的相互作用关系，节点越大则该化合物点度中心性（DC）越大，该化合物越处于核心位置。枇杷清肺饮的有效

成分主要是A7，A6，PPY4，即槲皮素、异鼠李素、茶儿茶素。药物-疾病交集靶点中与有效成分联系密切的有前列腺素内过氧化物合成酶2（PTGS2）、雌激素受体1（ESR1）和雄激素受体（AR）等，见图6。

图6 药物-活性成分-作用靶点-疾病网络

2.6 活性成分与核心靶点的分子对接验证 选取3 个核心靶点PTGS2、ESR1、AR 和网络中相应活性成分茶儿茶素、槲皮素、异鼠李素进行分子对接，所得到的结果见表3，可视化结果见图7。其中最低结合能≤-12.4 kcal/mol，最高结合能≤-3.9 kcal/mol表明药效分子与蛋白对接效果良好，结合能越低，表明分子与蛋白结合能力越佳。由表3 可见3 个靶蛋白与活性成分均有较好的结合力，结合上述实验结果，表明枇杷清肺饮治疗痤疮的主要活性成分可通过调节以上靶点来实现。

图7 核心靶点与活性成分分子对接

表3 分子对接结果信息

3 讨论

枇杷清肺饮是中医治疗痤疮的经典方之一，由枇杷叶、桑白皮、黄连、黄柏、人参和甘草6 味药组成，有清解肺胃热毒之效，常用来治疗痤疮的肺经风热证。其中枇杷叶为君，有清泄肺胃热之功；桑白皮可入上焦以助君药清肺热，向下可利水，以助热从小便去；黄连可助枇杷叶清胃之湿热；黄柏可入下焦以清湿热，三药合用，上中下三焦之热皆能泻之；人参、甘草可泻阴火，且能反佐寒性药物防其苦寒伤胃。现代研究发现枇杷清肺饮不仅有抗毛囊角化作用[7]，还能降低睾酮水平和调节睾酮/雌二醇比例[8]从而有效防治痤疮的发生与发展。

本研究通过网络药理学筛选出枇杷清肺饮治疗痤疮的活性成分共175 个，其中作用靶点最多的是山奈酚（A2）、槲皮素（A7）、茶儿茶素（PPY4）和异鼠李素（A6）。痤疮炎性反应中的炎性因子，如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）和IL-1α 等，能促进毛囊口角化以及粉刺形成[9]。此外雄激素水平失衡也可导致痤疮的发生，其中大量游离胰岛素与胰岛素样生长因子-1（IGF-1）结合，可促使雄激素分泌增多，继而导致皮脂腺分泌增加从而引起毛囊堵塞及毛囊口角化[10]。而山奈酚能通过IκB激酶-β（IKK-β）/TNF-α 信号通路抑制炎性反应和提高机体对胰岛素的敏感性[11]；槲皮素可通过减少IL-1β 和IL-6[12]发挥抑制炎性介质和细胞因子的作用。另外饮食因素诱发或加重痤疮与IGF 调节PI3K-Akt 信号通路有关[13]，而槲皮素有抑制PI3KAkt 信号通路的作用[14]；茶儿茶素能抑制5-α 还原酶的活性从而抑制皮脂的产生，来减轻或消除痤疮的发生[15]，此外茶儿茶素还能通过抑制核因子-κB（NF-κB）活性降低TNF-α 基因表达达到抗炎作用[16]。有研究报道异鼠李素可抑制NF-κB 信号通路来影响痤疮的发生[17]。

本研究得到枇杷清肺饮治疗痤疮的19 个关键靶点，如AKT1，IL-6，TP53 等。其中AKT1 是PI3K信号通路的主要下游靶蛋白之一，其功能异常可引发糖、脂代谢障碍，继而导致胰岛素抵抗[18]，而有报道称胰岛素与雄激素水平呈正相关[19]，故能使雄激素水平失衡。Zhou 等[20]用棕榈酸刺激HaCaT 角质形成细胞，可引起IL-6 等炎性因子的产生和细胞增殖，从而潜在地促进痤疮炎性反应和毛囊皮脂腺导管过度角质化；并且有研究证实炎性因子IL-6 参与了痤疮的发病[21]。TP53 虽是抑癌基因，但有研究发现TP53 除了能抑制雄激素受体的表达，还能诱导抑制异维A 酸效应的关键诱导物的产生[22]，故认为上调转录因子TP53 是治疗痤疮的关键[23]。

在对枇杷清肺饮治疗痤疮的靶点进行分析后，发现共有靶点主要与痤疮发病机制中的炎性反应、皮脂代谢有关，涉及PI3K/AKT、MAPK、TNF 等信号通路。根据文献报道，PI3K/AKT 信号通路存在于各种细胞中，是调节脂质代谢的信号通路，可调控痤疮皮脂代谢[24]。此外多项研究发现，当各种刺激因素活化PI3K/Akt 时，能激活其下游靶点AKT 和多种转录因子，产生胰岛素抵抗而参与痤疮的发病[25]。MAPK 通路是介导细胞反应的一个重要通路，而P38MAPK 通路是MAPK 家族之一。有研究发现藏雪莲多糖可通过P38MAPK 通路抑制IL-6、TNF-α的表达，调节TNF-α、IL-1 等炎性因子的产生进而抑制炎性反应[26]。TNF 信号通路通过与肿瘤坏死因子-α 受体（TNFR）结合起作用，当二者结合时可激活NF-κB 信号通路促进细胞增殖，从而参与机体的炎性反应[27]。除以上信号通路外，枇杷清肺饮治疗痤疮的靶标也有部分富集在NF-κB 信号通路、胰岛素抵抗等通路上，现有研究表明这些通路与痤疮有一定关系[10，28]。

分子对接结果显示槲皮素、茶儿茶素、异鼠李素能与PTGS2、ESR1、AR 受体蛋白较稳定地自发结合，故验证这3 种活性成分是枇杷清肺饮的核心药效成分。因此枇杷清肺饮可能通过其活性成分与疾病核心靶点蛋白发生相互作用而达到治疗痤疮的目的。

网络药理学仅从理论上出发排除了中药剂量、煎煮等因素等影响，所得出的结论仍需要进一步实验研究来证明。但不可否认枇杷清肺饮这一经典方剂治疗痤疮有很大的潜力，其有效成分、作用靶点和作用通路，与其他单味中药或成分治疗相比更加广泛、全面，并且本次网络药理学研究与现有的临床和基础研究结果相一致。部分信号通路与痤疮是否存在一定的联系目前虽然无法证明，但这也为研究中药治疗痤疮的作用机制研究提供了一个新的方向。