高效液相色谱法同时测定坤泰胶囊中7 种成分含量

2023-05-11巫悦

中国药业 2023年9期

巫悦

（东南大学附属中大医院江北院区，江苏南京 211500）

坤泰胶囊是由熟地黄、黄连、白芍、黄芩、阿胶和茯苓6 味药材组方的中药复方制剂，具有滋阴清热、安神除烦功效。用于绝经期前后诸证阴虚火旺者，潮热面红、自汗盗汗、心烦不宁、失眠多梦、头晕耳鸣、腰膝酸软、手足心热、卵巢功能衰退更年期综合征见上述证候者，现收载于2020年版《中国药典（一部）》，以黄芩中的黄芩苷［1］314和黄连中的盐酸小檗碱［1］316为含量测定的指标成分。目前，关于坤泰胶囊的其他指标成分含量测定的研究较少，多为临床应用研究［2-4］。中药复方制剂成分复杂，药效的发挥往往是多种活性成分相互作用的结果，故多成分测定可更准确、全面地评价中药复方制剂的内在质量。2020年版《中国药典（一部）》中对熟地黄［1］130、白芍［1］108、黄连和黄芩分别以地黄苷D、芍药苷、盐酸小檗碱和黄芩苷作为指标成分进行质量控制。结合文献［5 - 9］，本研究中建立了同时测定坤泰胶囊中地黄苷D、盐酸小檗碱、芍药苷、黄芩苷、黄芩素、没食子酸、毛蕊花糖苷7 种成分含量的高效液相色谱法，以为进一步完善该制剂的质量标准提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters 2695 型高效液相色谱系统（美国Waters 公司），配有2996型PDA检测器；AB-135S型电子分析天平（瑞士Mettler - Toledo 公司，精度为0.01 mg）；KQ5200DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，功率为500 W，频率为50 kHz）。

1.2 试药

坤泰胶囊（贵阳新天药业股份有限公司，批号分别为210415，210622，210617）；地黄苷D 对照品（批号为112063 - 202103，纯度为94.2%），盐酸小檗碱对照品（批号为110713-202015，纯度为85.9%），芍药苷对照品（批号为110736/ 202145，纯度为94.6%），黄芩苷对照品（批号为110715-202122，纯度为94.2%），黄芩素对照品（批号为111595-201808，纯度为97.9%），没食子酸对照品（批号为110831-201906，纯度为91.5%），毛蕊花糖苷对照品（批号为111530 - 201914，纯度为95.2%），均购自中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈均为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为娃哈哈纯净水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Waters C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～12 min时35%A～45%A，12～35 min 时45%A，35～47 min 时45%A～53%A，47～60 min 时53%A～35%A）；流速：1.0 mL/ min；检测波长：275 nm（地黄苷D、黄芩苷、盐酸小檗碱、没食子酸、黄芩素），230 nm（芍药苷），338 nm（毛蕊花糖苷）；柱温：30 ℃；进样量：20 μL。

2.2 溶液制备

取地黄苷D、盐酸小檗碱、芍药苷、黄芩苷、黄芩素、没食子酸、毛蕊花糖苷对照品各适量，精密称定，置50 mL容量瓶中，加80%甲醇溶液超声（功率为500 W，频率为50 kHz）使溶解并定容，配制成地黄苷D、盐酸小檗碱、芍药苷、黄芩苷、黄芩素、没食子酸、毛蕊花糖苷质量浓度分别为0.300 5，0.527 0，0.260 4，0.840 3，0.184 6，0.095 1，0.080 3 mg/mL 的混合对照品贮备液。精密量取上述混合对照品贮备液4 mL，置20 mL 容量瓶中，加80%甲醇溶液定容，摇匀，滤过，即得混合对照品溶液。

取样品内容物适量，研细，取0.5 g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入80%甲醇溶液50 mL，称定质量，超声处理（功率为500 W，频率为50 kHz）40 min，放至室温，再次称定质量，用80%甲醇溶液补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

按样品处方工艺，分别制备缺熟地黄、黄连、白芍、黄芩的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

专属性试验：精密吸取2.2 项下混合对照品溶液、供试品溶液和阴性对照品溶液各适量，按2.1项下色谱条件进样分析，记录色谱图。结果显示，该色谱条件下地黄苷D、盐酸小檗碱、芍药苷、黄芩苷、黄芩素、没食子酸、毛蕊花糖苷色谱峰基线分离良好，7 种成分色谱峰的对称因子分别为0.93，1.02，0.98，1.05，1.04，0.96，1.06，与相邻色谱峰的分离度均大于1.5，且阴性对照无干扰。色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图1.Gallic acid 2.Paeoniflorin 3.Rehmannioside D 4.Baicalin 5.Verbascoside 6.Berberine hydrochloride 7.BaicaleinA.Mixed reference solution B.Test solution C-F.Negative reference solution（lack of Rehmanniae Radix Praeparate，Coptidis Rhizoma，Paeoniae Radix Alba，and Scutellariae Radix respectively）Fig.1 HPLC chromatograms

线性关系考察：精密吸取2.2项下混合对照品贮备液0.5，1.0，2.0，4.0，8.0，15.0 mL，分别置20 mL 容量瓶中，加80%甲醇溶液定容，按2.1 项下色谱条件进样测定，以峰面积（Y）为纵坐标、质量浓度（X，μg/mL）为横坐标进行线性回归。结果见表1。

表1 线性关系考察结果（n=6）Tab.1 Results of the linear relation test（n=6）

精密度试验：取同一批（批号为210415）样品适量，精密称定，按2.2 项下方法平行制备供试品溶液6 份，按2.1 项下色谱条件连续进样测定6 次，记录色谱峰。结果地黄苷D、盐酸小檗碱、芍药苷、黄芩苷、黄芩素、没食子酸、毛蕊花糖苷峰面积的RSD分别为1.32%，1.24%，0.85%，0.67%，0.94%，1.03%，0.77%（n= 6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取同一批（批号为210415）样品适量，精密称定，按2.2 项下方法平行制备供试品溶液6 份，按2.1 项下色谱条件进样测定，并计算各成分含量及RSD。结果地黄苷D、盐酸小檗碱、芍药苷、黄芩苷、黄芩素、没食子酸、毛蕊花糖苷的平均含量分别为6.235 4，11.3206，5.2368，17.4935，3.6529，1.9561，1.5637mg/g，RSD分别1.43%，0.93%，1.12%，0.85%，1.32%，0.74%，0.69%（n=6），表明方法重复性良好。

稳定性试验：取同一批（批号为210415）样品，依法制备供试品溶液，分别于制备后0，2，4，8，16，24 h 时按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果地黄苷D、盐酸小檗碱、芍药苷、黄芩苷、黄芩素、没食子酸、毛蕊花糖苷峰面积的RSD分别为0.66%，0.79%，1.11%，1.07%，1.34%，0.68%，1.41%（n=6），表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

加样回收试验：取样品（批号为210415）0.25 g，精密称定，共6份，分别置锥形瓶中，精密加入含地黄苷D、盐酸小檗碱、芍药苷、黄芩苷、黄芩素、没食子酸、毛蕊花糖苷质量浓度分别为2.905 2，5.242 6，2.512 8，8.472 0，1.814 8，0.926 6，0.802 4 mg/mL 的混合对照品溶液0.5 mL，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定，计算7 种成分的加样回收率。结果见表2。

2.4 样品含量测定

取3 批（批号分别为210415，210622，210617）样品各适量，精密称定，按2.2项下方法制备供试品溶液，平行2 份，按2.1 项下色谱条件进样测定，按外标法计算样品中地黄苷D、盐酸小檗碱、芍药苷、黄芩苷、黄芩素、没食子酸及毛蕊花糖苷的含量。结果见表3。

表3 样品中7种成分含量测定结果（mg/g，n=2）Tab.3 Results of the content determination of seven components in samples（mg/g，n=2）

3 讨论

3.1 指标成分选择

地黄是四大怀药之一。生地黄炮制而成的熟地黄，性由寒转温，味由苦转甘，功效由清转补，以滋阴补血、益精填髓为主，毛蕊花糖苷和地黄苷D 是其特征性成分［10］。黄芩为常用大宗中药材，黄酮类化合物黄芩苷和黄芩素为其特征成分，具有清热燥湿、泻火解毒、止血等功效［11］。芍药苷是白芍的药效物质，没食子酸等酚酸类成分具有显著的抗炎、抗肿瘤等药理作用，常作为白芍药材质量控制的指标成分［6］。黄连可泻肝火，去心窍恶血，止惊悸，其药用价值与其所含生物碱类成分密切相关，其中小檗碱是含量最丰富、最具代表性的化合物［12］。本研究中最终确定以地黄苷D、盐酸小檗碱、芍药苷、黄芩苷、黄芩素、没食子酸及毛蕊花糖苷作为含量测定的指标成分。

3.2 提取条件优化

预试验中考察了不同的提取方式、提取时间、提取溶剂和料液比对7 种成分提取效果的影响。超声处理（功率为500 W，频率为50 kHz）［13］和加热回流［14］均能提取完全，考虑超声操作更简便，最终选择超声提取。以7种成分的色谱峰峰面积大小作为评价指标，考察不同超声时间（30，40，60 min）对提取效果的影响，发现超声40 min 时各成分峰面积趋于稳定。考察不同体积分数（50%，80%，100%）乙醇，不同体积分数（50%，80%，100%）甲醇及水作为提取溶剂时对提取效果的影响［13-15］，结果80%甲醇和甲醇提取效率较高，最终选择80%甲醇作为提取溶剂。考察了不同料液比（1∶50，1∶100，1∶200，m/V）对提取效果的影响［14-16］，结果料液比为1∶50时提取不充分，料液比为1∶100和1∶200时可充分提取，从节约成本的角度考虑，最终选择料液比1∶100。故样品的处理最终以料液比1∶100 的80%甲醇超声（功率为500 W，频率为50 kHz）40 min，操作简便，且提取充分。

3.3 色谱条件优化［17-20］

采用二极管阵列检测器在190～400 nm 波长范围内扫描混合对照品溶液，结果地黄苷D、盐酸小檗碱、芍药苷、没食子酸、毛蕊花糖苷分别在278，265，230，272，338 nm 波长处有最大吸收，黄芩苷和黄芩素在280 nm波长处有最大吸收。但频繁的波长切换，会导致基线较大幅度漂移。最终采用在230 nm 波长处检测芍药苷，在275 nm 波长处检测地黄苷D、盐酸小檗碱、没食子酸、黄芩苷和黄芩素，在338 nm 波长处检测毛蕊花糖苷，既避免了波长的频繁切换造成基线不平稳，又保证了7 种成分均有适宜的灵敏度，分离度较好，且阴性对照无干扰。

7 种成分极性差异较大，故采用梯度洗脱。分别考察甲醇- 水溶液、乙腈- 水溶液作为流动相时各成分的色谱峰，结果没食子酸存在拖尾现象，流动相为甲醇- 水溶液时地黄苷D、盐酸小檗碱、芍药苷、黄芩苷、黄芩素、毛蕊花糖苷的分离效果溶液优于乙腈- 水溶液。预试验中通过加入不同浓度的磷酸改善没食子酸色谱峰的峰形，比较了甲醇- 0.1%磷酸溶液、甲醇- 0.2%磷酸溶液、甲醇- 0.4%磷酸溶液，结果无明显差异，最终流动相选择甲醇- 0.1%磷酸溶液，7 种指标成分在60 min 内均可洗脱完全。曾考察25 ℃和30 ℃2 个柱温对色谱峰的影响，结果柱温为30 ℃时毛蕊花糖苷与相邻杂质峰分离较佳，最终选择柱温为30 ℃。