miR-29a、PTEN、p53在育龄子宫内膜癌组织中的表达及与其术后复发转移的关系分析

杨 然 董莉丽 汪爱兵 李英霞 王学博 孙 丽 冯 磊

子宫内膜癌(endometrial carcinoma,EC)是女性生殖系统常见的雌激素依赖性上皮性恶性肿瘤,好发于绝经后的老年女性[1]。近年来,随着社会经济发展和人们生活水平的提高,EC呈现发病率逐年上升和发病年龄年轻化的趋势,其中多数年龄低于40岁的育龄患者临床症状出现较早,表现为分化好、局限好和无肌层浸润等特征[2-3]。目前临床多采用手术切除肿瘤病灶对无保留生育功能意向的育龄EC患者进行治疗,取得了一定的临床疗效,但尚缺乏有效预测术后复发转移的指标。微小RNA(microRNA,miRNA)是一类可调控基因转录后表达过程的单链非编码小分子RNA,可通过调控肿瘤细胞增殖、侵袭过程参与肿瘤发生发展过程,其中微小RNA-29a(microRNA-29a,miR-29a)在胃癌、乳腺癌和EC等多种肿瘤中均呈现异常表达[4-5]。分子生物学研究发现,张力蛋白同源物(phosphat and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN)和肿瘤抑制基因(tumor suppressor gene,p53)等抑癌基因的突变、失活与恶性肿瘤发生发展过程关系密切[6]。既往研究报道了EC患者临床病理特征和免疫组化与预后的关系[7],但少见EC患者癌组织miR-29a、PTEN、p53表达与术后复发转移相关性的报道。本研究主要探讨分析育龄EC患者癌组织miR-29a、PTEN、p53表达与术后复发转移的关系,旨在为育龄EC患者的临床治疗方案制定及术后复发转移风险评估提供参考。

1 材料与方法

1.1 一般资料

回顾性分析2017年1月至2018年12月在南阳市中心医院因EC进行手术治疗42例病理组织标本作为研究对象,并纳入观察组。纳入标准:年龄22～40岁;符合EC诊断标准,经病理检查确诊[8];患者及其家属充分了解手术治疗的利弊并签署知情同意书;术前未接受放化疗;临床资料完整。排除标准:合并严重心、肝、肾等脏器功能不全及其它免疫性相关性疾病;合并凝血功能障碍;合并其他部位恶性肿瘤;合并心理、精神疾病。另选取本院同期行子宫肌瘤切除术的21例正常子宫内膜组织标本作为研究对象纳入对照组。观察组平均年龄(29.82±2.44)岁,对照组平均年龄(29.75±2.49)岁。两组年龄无显著差异(P>0.05)。根据术后复发转移判断标准将观察组分为复发转移组19例和未复发转移组23例。本研究经南阳市中心医院伦理委员会批准通过。

1.2 研究方法

1.2.1 临床资料收集 通过临床电子病历系统,记录育龄EC患者年龄、体质量指数(body mass index,BMI)、合并多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome,POCS)、合并糖尿病、肿瘤组织学分级、FIGO分期、治疗方法、肿瘤直径、浸润深度、远处转移、淋巴结转移和淋巴脉管转移等一般病例资料。

1.2.2 癌组织miR-29a表达检测 手术切除的癌组织标本和正常子宫内膜标本用液氮研磨成粉末后,将裂解后样品或匀浆液冰上放置10 min,使得核蛋白与核酸完全分离,采用Trizol试剂法TIANGEN®RNA simple Total RNA Kit总RNA提取试剂盒,提取总RNA,逆转录为cDNA,反应严格按照说明书进行。取经过反转录的cNDA样本,使用ABI公司的定量PCR 7300进行荧光定量PCR反应,反应条件为:所有样品设置3个复孔,95 ℃ 15 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,重复40次。以U6作为内参,采用相对定量法分析miR-29a相对表达量,计算公式为[2-△△CT,△△CT=(ctmiR-29a-ctU6)肿瘤-(ctmiR-29a-ctU6)正常]。

1.2.3 PTEN、p53表达检测及结果判定 收集患者病理组织标本,采用10%中性福尔马林进行常规固定、脱水后石蜡包埋,4～5 μm切片脱蜡后,暴露抗原并进行一抗孵育,60 min后浸于缓冲液中冲洗3次。滴加二抗,水平放置切片,室温下孵育20 min,冲洗后在切片组织覆盖区域滴加显色试剂显色,出现棕黄色则终止显色。滴加苏木精核染1 min,缓冲液反蓝后自来水下冲洗2 min。依次加入75%、95%和100%酒精脱水2 min,中性树胶封片。PTEN、p53抗体及试剂相应的单克隆抗体购置莱卡公司,二氨基联苯胺(DAB)显色液、磷酸盐缓冲液(PBS)缓冲液由泉晖贸易国际有限公司生产,所有操作严格按照免疫组化试剂盒操作步骤进行。

由2名经验丰富的病理科医生参与阅片,并采用双盲法对免疫组化结果进行判定。采用二次计分法,对每个切片随机选取10个具有肿瘤成分的高倍视野,每个视野计数约100个肿瘤细胞,统计阳性细胞百分比和染色强度。其中,阳性判定标准[9]:阳性细胞百分比:≤10%即为0分,11%～25%即为1分,26%～50%记为2分,51%～75%记为3分,>75%记为4分。细胞染色强度:无着色记为0分,淡黄色记为1分,棕黄色记为2分,褐色记为3分。免疫组化评分=阳性细胞百分比评分×细胞染色强度评分。

1.2.4 术后随访 术后通过门诊和电话进行随访,术后1年内每2个月随访一次,2年后每4个月随访一次,随访截止时间为2021年12月31日。记录患者术后复发转移情况,总生存期从术后第一天起至随访截止日期或患者死亡。

1.2.5 术后复发转移判断标准[10]治疗结束半年后,排除再发恶性肿瘤的可能后,出现以下任意一项即可诊断:①妇科检查或影像学检查在盆腔、腹腔或远处发现肿瘤占位性病变;②血清肿瘤标志物水平呈现持续增高趋势;③在出现癌性胸腔积液、腹腔积液的患者胸腔、腹腔积液内检出肿瘤细胞。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 观察组与对照组miR-29a相对表达量和PTEN、p53阳性表达率比较

观察组miR-29a相对表达量、PTEN阳性表达率低于对照组,p53阳性表达率高于对照组(P<0.05)。见表1。

表1 观察组与对照组miR-29a相对表达量和PTEN、p53阳性表达率比较

2.2 育龄EC患者术后复发转移与其临床病理特征的关系

育龄EC患者术后复发转移与肿瘤直径、浸润深度、远处转移、淋巴结转移和淋巴脉管转移有关(P<0.05);与年龄、BMI、合并POCS、合并糖尿病、肿瘤组织学分级、FIGO分期无关(P>0.05),见表2。

2.3 复发转移组和未复发转移组miR-29a相对表达量和PTEN、p53阳性表达率比较

复发转移组miR-29a相对表达量、PTEN阳性表达率低于未复发转移组,p53阳性表达率高于未复发转移组(P<0.05)。见表3。

表2 育龄EC患者术后复发转移与其临床病理特征的关系

表3 两组miR-29a相对表达量和PTEN、p53阳性表达率比较

2.4 影响育龄EC患者术后复发转移的Logistic多因素分析

对影响育龄EC患者术后复发转移的因素进行变量赋值,因变量和自变量赋值情况见表4。Logistic回归分析结果显示,远处转移(OR=2.869,P=0.048)、miR-29a<(OR=2.807,P=0.028)、PTEN阳性(OR=2.489,P=0.0449)和P53阳性(OR=2.762,P=0.021)均为影响育龄EC患者术后复发转移的独立危险因素。见表4、表5。

表4 因变量和自变量赋值情况

表5 影响育龄EC患者术后复发转移的Logistic多因素分析

3 讨论

育龄EC是发病率仅次于乳腺癌、宫颈癌的女性常见恶性肿瘤,近年来,其发病率随生活方式的变化呈现逐年增高和发病年龄年轻化的趋势[11]。手术是无保留生育意向的育龄EC患者首选的治疗方法,部分患者在积极手术治疗后仍发生复发转移,对预后造成影响[12]。miRNA通过抑制翻译靶基因mRNA参与肿瘤发生发展过程,其中位于染色体FRA7H位点的miR-29a在癌细胞分化发育中发挥重要作用[13]。有研究发现,PTEN、p53等抑癌基因和原癌基因与EC的发病机制和复发转移关系密切[14]。本研究主要探讨分析育龄EC患者癌组织miR-29a、PTEN、p53表达与保育治疗后复发转移的关系。

本研究结果发现,观察组miR-29a相对表达量、PTEN阳性表达率低于对照组,p53阳性表达率高于对照组,说明miR-29a、PTEN、p53在育龄EC患者癌组织中呈现表达异常。miR-29a通过调节多种靶基因发挥其抑癌功能,其中有多种抗凋亡分子参与其中[15]。PTEN可使肿瘤细胞周期停滞在G1期,对肿瘤细胞生长具有负向调控作用,同时通过抑制细胞有丝分裂、诱导肿瘤细胞凋亡,达到抑制肿瘤发生发展的作用[16-17]。p53是野生型肿瘤抑制蛋白,可通过阻碍细胞周期,达到抑制肿瘤血管生成的作用。但其在基因突变后转为致癌基因,失去对细胞凋亡的调控作用,促进肿瘤的发生发展[18]。本研究中育龄EC患者癌组织中p53阳性表达率较正常子宫内膜组织中升高,提示免疫组化法检测出的p53可能为突变型。本研究中,育龄EC患者术后复发转移与肿瘤直径、浸润深度、远处转移、淋巴结转移和淋巴脉管转移有关,提示育龄EC患者术后复发转移可能与肿瘤直径、浸润深度和有无远处转移、淋巴结转移、淋巴脉管转移有关。

本研究结果显示,复发转移组miR-29a相对表达量、PTEN阳性表达率低于未复发转移组,p53阳性表达率高于未复发转移组,说明育龄EC患者miR-29a、PTEN、p53呈现异常表达,其表达异常可能预示着育龄EC患者预后不良。PTEN是即有双重磷酸酶活性的抑癌基因,其基因突变可导致细胞持续性增殖,影响肿瘤细胞的浸润和转移[19]。p53是具有抑制细胞生长、诱导细胞凋亡和促进DNA损伤修复作用的家族成员,作为与人类肿瘤相关性最高的抑癌基因,其基因突变可导致编码蛋白功能丧失,诱导肿瘤发生发展和术后复发转移[20]。大量研究显示p53阳性表达导致的蛋白功能缺失是其主要特征性改变,与EC呈正相关关系[21]。本研究中采用Logistic多因素分析影响育龄EC患者术后复发转移的因素,结果显示远处转移、miR-29a<1.92、PTEN阳性和P53阳性均为影响育龄EC患者术后复发转移的独立危险因素,进一步证实了育龄EC患者癌组织miR-29a、PTEN、p53表达与其术后复发转移密切相关,提示临床应重点关注miR-29a相对表达量、PTEN阳性表达率显著降低和和P53阳性表达率显著升高的育龄EC患者,针对性给予有效的干预措施,降低术后复发转移的风险。

综上所述,miR-29a、PTEN、p53在育龄EC患者癌组织中呈现表达异常,远处转移、miR-29a<1.92、PTEN阳性和P53阳性均为影响育龄EC患者术后复发转移的独立危险因素。本研究的不足之处在于样本例数较少,未对miR-29a、PTEN、p53表达情况与育龄EC患者临床特征的关系进行具体分析,后续仍需加大样本量深入研究验证。