RNF43对子宫内膜癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响

王仙婷 金彦斌 蔡俊宏 包 珊

子宫内膜癌(endometrial cancer,EC)是最常见的妇科肿瘤之一,每年造成全世界约74000位女性死亡[1]。子宫切除术仍然是治疗的主要手段,辅助化疗和/或放疗可使高复发风险或晚期疾病患者获益[2]。但癌症晚期/复发性疾病的治疗仍然具有挑战性,且化疗、激素治疗和靶向治疗仍在临床试验研究之中[2]。

1型子宫内膜癌占85%的病例,其中绝大多数病例表达雌激素受体α(ERα)。ERα是一种类固醇激素受体[3],ERα阳性患者对孕激素有反应[3]。此外,ERα是最好的疗效预测因子,它与临床疗效和存活率显著相关[4]。ERα表达降低与分化差、晚期肿瘤、疾病复发和不良预后相关[5],寻找能稳定ERα表达水平的靶点至关重要。

RNF43作为一种E3泛素连接酶,已被证明作为抑癌因子抑制结肠癌发展[6]。但在肺癌中,RNF43可作为促癌因子促进肺癌的恶化[7]。虽然有报道其在子宫内膜癌中频繁突变,但是具体的作用机制并不清楚[8]。本研究通过数据库分析RNF43在子宫内膜癌中高表达与良好的生存期有关,RNF43可抑制Ishikawa细胞的增殖、迁移、侵袭,并能稳定ERα的表达,有望作为稳定ERα表达的靶点,现将研究内容报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系 人子宫内膜癌Ishikawa细胞购自赛百慷(上海)生物技术股份有限公司。

1.1.2 siRNA的合成 3条siRNF43及NC由上海吉玛公司设计合成。序列如下:

表1 相关基因序列表

1.1.3 主要试剂 RNF43抗体购自美国Abcam公司,GAPDH抗体、辣根过氧化物酶标记的二抗均购自美国CST公司,CCK-8检测 试剂盒购自中国Biosharp公司,特异性RNF43 siRNA (特异性SiRNF43-1,SiRNF43-2,SiRNF43-3及其阴性对照(NC)、siRNA-Mate转染试剂均购自上海吉玛制药技术有限公司,RPMI 1640培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司,反转录试剂盒、荧光定量PCR检测试剂盒购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司,细胞裂解液、BCA蛋白浓度检测试剂盒、ECL化学发光试剂均购自中国Biosharp有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 将Ishikawa细胞均置于10%含胎牛血清、50 μg/ml青霉素和50 μg/ml链霉素的高糖培养基,在37 ℃、5%饱和湿度培养箱中培养,均贴壁生长,每日观察细胞生长情况,每天换培养基一次。

1.2.2 siRNA 转染 Ishikawa细胞接种于6孔细胞培养板,于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h后,将细胞随机分为siRNF43#1,siRNF43#2,siRNF43#3及NC组,按照siRNA-Mate转染试剂的说明书转染。细胞继续培养48 h后,进行后续实验操作。

1.2.3 CCK-8实验检测细胞增殖情况 将转染24 h的siRNF43和NC子宫内膜癌细胞,调整细胞浓度,于2000个细胞/每孔100 μl培养基接种于96 孔板,每组设置4个复孔,放入37 ℃恒温培养箱继续培养,24 h后每孔分别加入10 μl CCK-8溶液,继续培养2 h,2 h后为第1次所测即第1天,而后第3、5、7天置于酶标仪检测450 nm处各孔吸光度值(OD),实验重复3次。

1.2.4 细胞克隆形成实验检测细胞克隆形成能力 将转染24 h的siRNF43和NC子宫内膜癌细胞,调整细胞浓度,于2000个细胞/每孔接种于六孔板。细胞培养7 d,培养液每2 d更新一次。菌落染上了结晶紫。针对每种情况,统计给定区域中的克隆数量,实验重复3次。

1.2.5 细胞划痕实验检测迁移能力的变化 将转染好NC和siRNF43的子宫内膜癌细胞,胰酶消化,加入1 ml完全培养基调整细胞浓度为7×105/ml。每个小槽的左右小室各加70 μl细胞悬浮液。待细胞完全贴满皿底后拔出小槽PBS轻轻洗涤3次,加入1 ml培养基,同时拍照记录为0 h。每隔10 h拍照一次,直至迁移融合。

1.2.6 Transwell 实验检测细胞侵袭能力 提前一个小时在Transwell的上室中加入已稀释好的100 μl MG胶,培养箱孵育1 h。将转染24 h后的NC和siRNF43细胞,胰酶消化,加入碱血清培养基,重悬为5万个细胞/200 μl,做3个重复组。吸掉MG胶,将已重悬的细胞悬液加入上室中,下室中加入600 μl完全培养基后培养48 h。擦去上室细胞后固定细胞染色,光镜下随机选取视野计数并取平均值。

1.2.7 Western blot实验 分别收集转染48 h后各组Ishikawa细胞,加入细胞裂解液提取蛋白,采用BCA试剂盒检测蛋白浓度,在蛋白样品中加入适量加样缓冲液,沸水浴中加热5 min致蛋白变性。在上样孔中加入30 μl的变性蛋白样品,行SDS-PAGE电泳,分离蛋白后电转至PVDF膜上进行转模,然后置于含3%的BSA中封闭2 h。加入RNF43 一抗(1∶1000稀释),ERα一抗(1∶1000稀释)4 ℃下过夜。再加入按1∶5000稀释的二抗,室温下1 h,采用ECL化学发光,显影,以GAPDH为内参,计算各条带的相对灰度值。

1.2.8 PCR实验 分别收集Ishikawa细胞用Trizol法提取细胞总RNA,微量分光光度计测定各样品RNA浓度,将RNA逆转录合成cDNA。按照ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒说明书进行qRT-PCR实验。反应条件:95 ℃、30 s,95 ℃、5 s,60 ℃、30 s,40个循环;95 ℃、15 s,58 ℃、30 s,95 ℃、15 s。以β-actin为内参,采用2-ΔΔCt法计算RNF43 mRNA表达。RNF43上游引物:5'-AGT GGA TCT GGA GAA AGC TA-3',RNF43下游引物:5'-ATT CAG CTG TAG TCT CCT CT-3';β-actin 上 游 引物:5'-AAG GAT TCC TAT GTG GGC GAC-3',β-actin 下游引物:5'-CGT ACA GGG ALA GCA CAG CC-3'。

1.2.9 半衰期实验 将转染24 h后NC或siRNF43的Ishikawa细胞加入终浓度为100 μM的放线菌酮,然后在孵育0 h、4 h、8 h、12 h、16 h后收集细胞沉淀对RNF43、ERα进行Western blot检测。采用Image J软件扫描定量分析蛋白表达量。

1.3 数据统计

1.3.1 从 GEPIA 数据库中提取数据 GEPIA 数据库包含TCGA和GEO数据库 中常见恶性肿瘤样本和正常样本的RNA测序数据。通过使用GEPIA数据库提取RNF43基因在子宫内膜癌数据库中的表达情况,使用“Survival Plots”栏目分析RNF43基因与子宫内膜癌生存预后的关系。

2 结果

2.1 RNF43与子宫内膜癌的良好预后有关

利用 GEPIA 数据库生存分析功能发现,RNF43 高表达组与低表达组对子宫内膜癌患者的总生存率有意义(P<0.05) (图1),提示RNF43基因高表达与子宫内膜癌的良好预后有关。

图1 GEPIA 数据库中 RNF43的表达与子宫内膜癌患者预后的关系

2.2 RNF43特异性siRNA的筛选

通过WB和PCR实验,与NC组对比,siRNF43#1,siRNF43#2,siRNF43#3 mRNA和蛋白的表达量均降低(P<0.05)其中siRNF43#3敲低效果更明显,所以选择siRNF43#3进行后续的实验,简称siRNF43(图2)。

2.3 敲低RNF43促进Ishikawa细胞的增殖

CCK-8实验显示与NC组相比,siRNF43组细胞在第5、7天的时候增殖能力增强 (P<0.05)(图3)。

注:A为RNF43蛋白表达,B为RNF43 mRNA水平。各组相互对比,**为P<0.01,***为P<0.001。

注:与NC组比较,*为P<0.05,**P<0.01。

2.4 敲低RNF43促进Ishikawa细胞的克隆形成能力

克隆形成实验显示siRNF43组细胞相对于NC组,克隆形成数增多(P<0.05),见图4。

2.5 敲低RNF43促进Ishikawa细胞的侵袭

与NC组相比,siRNF43组细胞侵袭数增多(P<0.05),见图 5。

2.6 敲低RNF43促进Ishikawa细胞的迁移

与NC组相比,siRNF43组34 h后愈合率增高(P<0.05),见图6。

2.7 敲低RNF43后ERα表达量减少

与NC组相比,siRNF43组细胞中ERα表达量降低(P<0.05),见图7。

2.8 RNF43增加ERα的稳定性

加入放线菌酮后,在同一时间点检测NC组和siRNF43组RNF43,ERα的表达。与NC组相比对,siRNF43组ERα表达低于NC组,这一结果说明RNF43可以增加ERα蛋白的稳定性,见图8。

注:与NC组比较,***为P<0.001。

注:与NC组比较,***为P<0.001。

注:与 NC 组相比,***为P<0.001。

注:与 NC 组相比,***为P<0.001。

3 讨论

子宫内膜癌是妇科最常见的恶性肿瘤之一,85%的病例都是1型子宫内膜,而且绝大多数病例都表达ERα[9]。雌激素受体的表达和预后良好相关,且对激素治疗敏感,而雌激素受体的消失和癌症的复发相关[10]。寻找能稳定雌激素受体表达的靶点对雌激素受体稳定至关重要。越来越多证据表明泛素化系统和肿瘤的发展密切相关[11]。RNF43是一种E3泛素连接酶,RNF43最初是作为致癌蛋白在结肠癌中被发现[12]。在HEK293T人类癌细胞系中,它可作为一个肿瘤抑制因子阻断了WNT的功能及在大肠癌细胞系HCT116中引入RNF43突变,其对外源WNT的作用消失[6]。在卵巢癌,胰腺癌中发现其频繁突变,提示其作为肿瘤抑制因子的可能性[13-14]。但在肺癌中,RNF43却可以通过激活c-Arc,介导磷酸化的E-cadherin泛素化和降解,促进肺腺癌上皮-间充质转化[7]。但是它在子宫内膜癌中的具体生物学功能还未知[8]。在本研究中,我们通过GEPIA数据库分析发现高表达的RNF43和子宫内膜癌的良好预后相关,接着选用了雌激素受体阳性的子宫内膜癌细胞Ishikawa进行实验,沉默RNF43后,发现Ishikawa细胞的增殖、侵袭和迁移能力增强,RNF43在子宫内膜癌细胞中呈现抑制生长的作用。沉默RNF43可以降低子宫内膜癌细胞中ERα蛋白的表达量,且缩短ERα的半衰期,进一步说明RNF43可通过稳定ERα的表达,抑制子宫内膜癌细胞的生长。

注:与 NC 组相比,***为P<0.001。

综上所述,RNF43可抑制雌激素受体阳性子宫内膜癌细胞Ishikawa 的增殖、侵袭和迁移能力,并增加ERα蛋白的表达,有望作为子宫内膜癌患者治疗的新靶点。另外,本文只用了单一细胞系,只做了RNF43的沉默,未涉及到过表达验证,且只研究其对ERα蛋白的表达,没有涉及到雌激素受体对下游靶基因的转录活性。后续实验将进一步探索RNF43稳定ERα抑制子宫内膜癌细胞生长的分子通路。