直肠癌组织中ADAM12、A2aR表达水平与神经脉管侵犯及5-FU化疗敏感性的关系

张琦玥 李义芬 王凤西

直肠癌(carcinoma of the rectum)属于大肠癌的一种,癌症病变处为直肠与乙状结肠的交接处至齿状线[1-3],即起源于直肠和肛管的癌症统称为直肠癌,是消化道中常见的恶性肿瘤[4]。早期直肠癌的预后比较好,如果通过根治性手术切除,患者可以长期存活[5-6]。晚期直肠癌的预后比较差,可危及患者生命。在我国直肠癌的发生率较结肠癌高60%,且随着我国人口老龄化,结直肠癌的发生风险也呈现上升趋势[7-8]。去整合素金属蛋白酶12(ADAM12)在肿瘤病变中异常高表达。A2a 型腺苷受体(adenosine 2a receptor,A2aR)能促进肿瘤细胞干性提高,激活肿瘤通路,促进肿瘤转移。目前国内关于ADAM12、A2aR与直肠癌关系的研究较少。因此,本实验就直肠癌组织中ADAM12、A2aR表达水平与神经脉管侵犯及5-FU化疗敏感性的关系展开以下研究。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选取我院2019年6月到2021年6月收集的62例新型辅助放化疗治疗前活检石蜡标本及术后肿瘤组织标本。男性33例,女性29例,年龄30～85岁,平均(54.63±2.45)岁。纳入标准:①术前患者均采用肠镜活检病理,影像学检查。②所有标本均在术中取出时使用10%的福尔马林液体进行保存,直至石蜡包埋。③所有患者癌组织均取自癌肿瘤全层并且剔除坏死组织。④符合《实用结直肠癌外科学》[9]中关于直肠癌的相关诊断标准。排除标准:①患者在诊断治疗前未接受相关治疗。②对药物过敏患者。③合并有心肝肾等脏器肿瘤性病变。④不能完成实验全过程者。

1.2 试剂

采用上海雅吉生物科技有限公司提供的兔多克隆抗体anti-A2aR(货号ab5236),羊抗人ADAM12多克隆抗体、通用型二抗试剂盒、山羊二抗试剂盒来自艾博抗上海贸易有限公司(货号ab4215),DAB显色试剂盒、苏木精染液、中性树胶来自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 治疗方法 术后第10天,经锁骨下穿刺或切开头静脉,将化疗泵导管置入上腔静脉,经X线证实导管位置后,固定导管,注药泵埋于胸大肌上缘皮下,切口以可吸收线缝合。以无损伤针刺入注药泵并用不粘帖固定,推注肝素盐水回抽证实导管通畅,静脉点滴艾恒200 mg,2小时以上;然后接三通管,用化疗泵球囊(200 ml)持续静脉点滴5-FU 3000～3500 mg,96 h,同时每天输注CF 200 mg,21天为1个周期。为保证治疗顺利完成,预防消化道反应,采用格拉司琼、维生素B等药物静脉点滴,口服升白细胞药物及保肝药物等。均行4个以上治疗周期。

1.3.2 ADAM12、A2aR的检测方法 实验前取两块石蜡切片,分别用来检测ADAM12与A2aR。通过使用二甲苯Ⅰ、Ⅱ对石蜡切片进行脱蜡25 min,采用四川科伦药业有限公司提供的梯度酒精100%、95%、75%、50%逐级水化5 min,各5 min。使用磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS)冲洗10 min,共2次。冲洗完后加入ADAM12一抗(1∶200),在36.5 ℃温度下孕育1 h后再次进行PBS冲洗,加入DAB显色剂,后进行常规的冲洗、脱水封片,制成AMAM12标本。A2aR则在PBS冲洗后加入一抗A2aR、CD133。在36.5 ℃下持续孕育孵化1 h,PBS冲洗3次,甩干后用辣根酶标记链霉卵白素工作液滴在组织上,继续在36.5 ℃下孕育30 min,再用PBS冲洗3次。加入DAB显色剂待完成后用PBS冲洗,完成显色后,用苏木精反蓝,用梯度酒精脱水,二甲苯封片。

1.4 结果判定

1.4.1 5-FU化疗敏感性判断标准 采用直肠癌消退分级标准(rectal cancer regression grade,RCRG)进行分级,Ⅰ级肿瘤放疗反应好,肉眼可看病灶减小或不见,镜下癌细胞不可见或仅剩下少量的癌灶;Ⅱ级镜下有明显的纤维化,肉眼可见的肿瘤存在;Ⅲ级肿瘤反应较差,肉眼可见没有变化,镜下极少纤维化或无纤维化。

1.4.2 ADAM12结果判定 在直肠癌中染色观察为棕褐色、棕黄色,染色位置位于胞质和胞膜,细胞核不染色。染色标准判定:0分为无色、1分为淡黄色、2分为棕黄色、3分为棕褐色。细胞着色评分标准:1分为0～25%,2分为25%～50%,3分为50%～75%,4分为75%～100%。评判结果由着色细胞数与染色强度乘积为判定标准:阴性<4分,≥4分为阳性。

1.4.3 A2aR判定结果 阳性为细胞膜与细胞质出现黄染颗粒。染色强度评分标准:0分为不着色,1分为黄色,2分为棕黄色,3分为黄褐色。阳性细胞比例评分标准:1分为≤25%,>25%～50%为2分,>50%～75%为3分,>75%为4分。阳性判定标准:分值为上两项判断标准乘积,总分为12分。阴性(-)(+/-),阳性(+)(++)。0～4分为阴性,5～12为阳性。以上2组判定结果均有两名病理科主治医师综合判定。

1.5 统计学方法

应用SPSS 22.0软件对数据进行统计学分析。计数资料以百分率表示,采用χ2检验。使用Spearman分类变量分析A2aR与ADAM12的表达强度和化疗敏感性相关性。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 A2aR、ADAM12在直肠癌组织中的表达

A2aR胞膜胞质呈现黄色颗粒状,阴性者21例,阳性者41例。ADAM12胞浆胞质呈现棕褐色或棕黄色,阴性为23例,阳性为39例。

2.2 新型5-FU化疗效果

所有患者中对新型5-FU化疗敏感者(RCRG Ⅰ～Ⅱ级)为30(48.38%)例,不敏感者32(51.62%)例。2.3 直肠癌中A2aR、ADAM12蛋白表达与化疗敏感性和临床病理学特征关系

A2aR蛋白的表达与肿瘤大小、患者性别、年龄大小、神经脉管侵犯程度无关(P>0.05),与TNM分期、浸润程度有关(P<0.05)。ADAM12蛋白的表达与肿瘤大小、患者性别、年龄大小、神经脉管侵犯程度无关(P>0.05),与浸润程度、TNM分期有关(P<0.05)。直肠癌化疗敏感性与浸润程度、TNM分期、A2aR和ADAM12表达强度有关(P<0.05)。见表1。

表1 直肠癌中A2aR、ADAM12蛋白表达及化疗敏感性与临床病理学特征关系/例

2.4 直肠癌组织中A2aR、ADAM12与5-FU化疗敏感性的相关性

直肠癌组织中A2aR表达与5-FU化疗敏感性呈正相关(γ=0.352,P<0.001)。直肠癌组织中ADAM12表达与5-FU化疗敏感性呈正相关(γ=0.276,P<0.030)。见表2。

表2 直肠癌组织中A2aR、ADAM12与5-FU化疗敏感性的相关性/例

3 讨论

化疗是直肠癌患者最为重要的治疗环节,选择何种的化疗方式能有效决定患者病情的走向。化疗药物作用的形式均是杀死直肠癌细胞的表达因子,本研究中ADAM12、A2aR均是直肠癌细胞的重要表达因子。

A2aR是与腺苷结合共同抑制免疫细胞CD8+T,以此达到肿瘤免疫逃逸。SHI等[10]研究发现A2aR通过CD8+T时进行诱导使其凋零,进行免疫逃逸。腺苷与A2aR结合能促进肿瘤细胞干性提高,激活肿瘤通道促进肿瘤的转移[11-12]。干性的肿瘤细胞能通过细胞周期阻滞,抑制凋零,降低DNA损伤的修复,因此对抗肿瘤免疫的恢复与阻断A2aR能有效抑制肿瘤细胞的增殖。本研究结果显示A2aR表达与5-FU化疗敏感性呈正相关,在直肠癌治疗中呈现高表达状态,A2aR能成为治疗直肠癌的新靶点。

ADAM12为ADAM重要成员之一。据有关研究显示,正常情况下ADAM12在人足月胎盘中表达丰富[13]。目前研究显示,多种肿瘤性病变均与ADAM12异常表达有关。有研究发现[14],在胃癌组织中ADAM12呈现出高表达,通过与粘附因子相互作用以及受体反式激活引起。本实验为了探究ADAM12在直肠癌中的表达,对ADAM12进行测定,发现在直肠癌中呈现阳性表达。肿瘤细胞的增殖与转移是患者死亡的重要原因,ADAM12异常表达会引起结直肠癌肿瘤组织增殖与转移。Wang、Dekky等[15-16]学者研究显示ADAM12能增强肿瘤的侵袭。实验显示ADAM12与TNM分期相关联。在子宫癌患者中ADAM12呈现出高表达,且TNM与ADAM12的表达水平呈现正相关性,增强了肿瘤的转移与侵袭。实验中A2aR、ADAM12对神经脉管具有侵犯,但不具有意义。

综上所述,直肠癌患者中ADAM12、A2aR阳性表达率较高,对神经脉管侵犯度不高,与5-FU化疗敏感性呈现正相关。ADAM12、A2aR可作为直肠癌的靶点进行针对治疗,进一步抑制结直肠癌的增殖与转移。