PTK7在口腔鳞状细胞癌中的表达及临床意义

贾国栋， 汪 轶， 徐 震

（上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔综合科，上海交通大学口腔医学院，国家口腔医学中心，国家口腔疾病临床医学研究中心，上海市口腔医学重点实验室，上海市口腔医学研究所，上海 200011）

口腔癌是全球第九种常见的癌症，组织学上，90%的口腔癌起源于鳞状细胞[1]。尽管现阶段口腔鳞状细胞癌（OSCC）的诊断和治疗技术有了很大的进展[2]，但OSCC的死亡率仍较高，总体预后较差，生存率约为55%～65%[3]。近年来，罹患口腔癌的患者日趋年轻化，早期诊断是降低口腔癌死亡率的关键，以利于提高总体生存率和预后[2]。因此，阐明OSCC的发生、发展、转移及复发机制，提高患者生存率是重要的研究方向。本研究采用免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法检测酪氨酸蛋白激酶7（PTK7）在OSCC组织中的表达，探讨PTK7的表达水平与OSCC分化程度、生存率等临床相关因素的关系。

1 资料和方法

1.1 标本

本研究中的113例OSCC组织样本来自2006年1月—2008年12月上海交通大学医学院附属第九人民医院的住院患者，所有样本均有完整的病史，均经病理检查确诊为OSCC（图1），由2位经验丰富的病理学专家进行阅片。同时，行全身检查无其他恶性肿瘤，并且排除患者有局部手术、放疗和化疗史。本研究获得上海交通大学医学院附属第九人民医院伦理道德委员会批准（批准号：2018-86-T77），所有程序均按照上海交通大学批准的指导方针执行，参与本研究的所有患者均提供书面知情同意书。

图1 OSCC组织HE染色图Figure 1 HE staining of OSCC tissues

1.2 方法

1.2.1 样本处理 首先将组织样本切片置入恒温箱（60 ℃）中进行烘烤，时长60 min；然后将其置于二甲苯中进行脱蜡，取出样本后进行水化，滴加3%过氧化氢溶液于组织样本上（目的为阻断内源性过氧化物酶的活性）。

1.2.2 抗原修复 一抗孵育：组织切片样本上滴加兔多克隆PTK7抗体（Proteintech公司 ， 美国；工作浓度为1∶300），4 ℃下孵育过夜；二抗孵育：组织样本滴加辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗（碧云天公司，中国；工作浓度为1∶50），室温孵育60 min；DAB显色：显微镜下观察组织样本出现棕色或棕黄色颗粒，清水浸泡，以终止反应；使用苏木精复染，清水浸泡10 min返蓝；将组织切片样本（按照脱蜡的逆向顺序）进行逐级乙醇脱水干燥，用二甲苯对组织进行透明、封片。

1.2.3 数据分析 PTK7染色结果的判断标准：细胞膜出现黄色或棕黄色的细小颗粒为阳性，胞质表达而胞膜不表达为阴性，根据阳性细胞所占的比例判断。染色强度：无色0分，黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分； 阳性细胞率1%～10% 为1分，11%～50%为2分，51%～80%为3分，81%以上为4分。染色程度：基本不染色为0分；淡黄色为1分；黄色为2分，棕黄色为3分。将染色强度评分与染色程度评分相乘的积作为综合评分，＞4分为阳性表达，≤4分为阴性表达。

1.3 统计学分析

所有测量数据均采用 SPSS20.0软件进行分析。PTK7与OSCC病理因素的关系采用χ2检验及非参数检验分析。PTK7蛋白表达水平的高低和与临床组织样本预后的关系采用 Kaplan-Meier法及Long-Rank检验，Cox回归模型多因素分析PTK7蛋白表达与各种临床病理参数的关系，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 OSCC及正常组织中PTK7蛋白的表达

113例OSCC组织中有70例（61.9%）PTK7蛋白表达阳性，65例癌旁正常组织均无PTK7蛋白的表达。在OSSC组织中，PTK7蛋白阳性表达与阴性表达差异有统计学意义（P＜0.05，表1）。

表1 PTK7 蛋白在OSCC及正常组织中的表达（n）Table 1 Relationship between PTK7 expression in OSCC and normal tissue (n)

2.2 PTK7在OSCC中的表达及其与临床病理特征的相关性

在OSCC组织中，PTK7的染色强度相比正常组织明显增强，PTK7染色主要位于细胞质及细胞膜中（图2）。PTK7蛋白表达与临床病理参数之间的关系如表2所示，经卡方检验， PTK7蛋白的表达与OSCC的临床病理参数（年龄、性别、分化程度、临床分期、肿瘤大小、局部浸润范围及淋巴结转移）相比较，差异均无统计学意义（P≥0.05，表2）。

表2 OSCC中PTK7蛋白的表达与临床病理学特征的关系Table 2 Relationship between the expression of PTK7 and the clinicopathologic features of OSCC specimens

2.3 OSCC组织中PTK7蛋白表达与患者预后的关系

Cox回归模型分析结果显示，113例OSCC样本中，PTK7阳性表达组为70例，阴性表达组为43 例，2组差异有统计学意义（P＜0.05，表3）。Kaplan-Meier法分析结果显示， PTK7阴性组总生存率显著高于阳性组（P＜0.05，图 3）。

图3 Kaplan-Meier法分析PTK7蛋白表达对OSCC患者预后的影响Figure 3 Kaplan-Meier survival analysis of PTK7 protein expression on the prognosis of patients with OSCC

表3 OSCC患者生存相关因素的Cox回归模型分析Table 3 Cox regression analysis of factors associated with survival in OSCC patients

3 讨论

本研究通过PTK7在OSCC组织中的表达及其与OSCC发展、预后的关系，分析PTK7在OSCC中的作用，结果提示，PTK7高表达表示OSCC患者有更差的预后。OSCC的发展是一个多因素、分阶段的复杂过程，伴随多种功能基因参与，选择性颈淋巴结清扫术能提高早期OSCC患者的生存率[4]。因此，阐明OSCC的发生发展、转移及复发机制是提高患者生存率的重要研究方向。有学者[5]以OSCC临床样本组织作为研究模型，采用膜蛋白质谱技术鉴定肿瘤干细胞表面蛋白分子与其生物学特性的关系时发现，多种细胞黏附相关分子在肿瘤干细胞表面异常表达，其中PTK7的表达水平与肿瘤干细胞的生物学行为密切相关。在许多人恶性肿瘤组织中，PTK7呈现高表达，其中包括食管鳞癌、甲状腺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、非小细胞肺癌、胃癌、肝癌及急性髓细胞白血病[6-10]。本研究中，113例OSCC组织中有70例PTK7蛋白表达阳性，阳性表达率为61.9%，OSCC癌旁非典型增生及正常鳞状上皮中，PTK7蛋白表达均为阴性，这说明PTK7的表达与OSCC有明显的相关性。本研究分析表明，PTK7的蛋白表达与OSCC临床相关影响因素均无统计学意义（P≥0.05，表 1）； Kaplan-Meier生存分析结果显示，PTK7阴性组总生存率显著高于阳性组，在多因素分析中，PTK7 的表达增加与OSCC患者的总生存期呈负相关，说明PTK7在OSCC的发生、发展中可能起到辅助或促进作用，从而缩短了患者的生存时间，提示其可以预测OSCC的预后。

研究[11-12]表明，一种抗体药物靶向PTK7的偶联物可有效治疗乳腺癌、卵巢癌和非小细胞肺癌。PTK7在头颈鳞状细胞癌细胞系微球细胞中的表达高于其在黏附细胞中，提示PTK7可作为头颈肿瘤干细胞的标志物[13]。已有研究[14]表明， PTK7在食管鳞状细胞癌组织和肿瘤干细胞样细胞中显著上调。干细胞样细胞功能的研究[14]表明，抑制PTK7表达减少了干细胞样细胞微球的形成，促进了细胞凋亡，并抑制了它们的迁移和侵袭能力。PTK7通过调节p53增强了食管鳞状细胞癌干细胞样细胞的迁移和侵袭能力。因此，这项研究[15]表明， PTK7 是食管鳞状细胞癌治疗的潜在靶点。使用PTK7抑制剂会增加头颈鳞状细胞癌对厄洛替尼的敏感性，由此提示，PTK7与头颈鳞状细胞癌化疗效果及预后有关联[16]。本研究表明，PTK7 的表达增加与OSCC患者的总生存期呈负相关。据报道[17]，PTK7与Wnt信号通路相关，通过经典的 Wnt/β连环蛋白通路、Wnt/Ca2+通路、平面细胞极性通路活化Wnt信号通路，PTK7在肿瘤的发生、发展中发挥调节作用。PTK7调节功能大多与Wnt/β连环蛋白通路相关联，无论 PTK7 是作为启动子还是抑制剂，其在经典的 Wnt/β-Catenin 通路中的作用仍然存在争议[15，17]。

综上所述，本研究显示，PTK7的高表达提示患者预后不良，PTK7可作为OSCC的预后指标，有继续深入研究的价值。