黄芪提取方法对化学成分及抗氧化活性的影响

陈壁娜

黄芪为多年生豆科类草本生长的植物，味甘且性温，最早出现于医学典籍《神农本草经》，因其具有养血滋津、敛疮新生、疏通散痹、固表益气等效用，可在调节免疫、抗氧化、保肝、抗炎等中发挥多重药理学作用[1]。在我国，黄芪用途广泛，不仅能够参与心血管、呼吸、内分泌等疾病的治疗且效果良好，同时在保护心肌细胞、调节血压等方面也取得了一定的进展[2]。黄芪不仅包含黄酮、皂苷、多糖、微量元素以及其他有机物等化学成分，同时也包括甲苷类、多糖类及酮类化合物，这些均是黄芪中较为重要的活性成分。现阶段，随着药理学研究的不断深入以及提取检测方式的不断完善，临床中常将有关黄芪的药理活性以及化学成分等作为关键研究对象，而研究中出现的差异性表现则是对应成分提取方法不同的体现。本研究对黄芪不同提取方法对化学成分的影响进行探究，旨在为临床药物提取方法提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂本研究黄芪源于来北京同仁堂大药房。取晾晒干燥的黄芪根粉碎，过筛30 目，筛下产物经封闭干燥包装后保存备用。将黄芪根切成厚度为2mm 的薄片用于水磨法进行提取。纤维素酶、甲醇、正丁醇、氨水、苯酚、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2，2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）、2，4，6-三吡啶基均三嗪、维生素C、福林酚试剂。

1.2 仪器与设备超声波多频清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司，型号：SB-500DTY）；分离式磨浆机（沧州利达民用机械厂，型号：DM-ZF-105）；电热恒温水浴锅（北京科伟永兴仪器有限公司，型号：HH-2A）；紫外可见分光光度计（日本岛津公司，型号：UV-1700）；高效液相色谱仪（美国Waters 公司，型号：LC-2010AHT）。

1.2 方法

1.2.1 独立提取 ①水磨提取（S）：取黄芪片10g，加入60ml 蒸馏水，在40℃下将黄芪片浸泡约7h，研磨过滤后将滤渣进行重复提取。②超声辅助提取（C）：依据文献方法[3]取黄芪粉3g，添加60ml 蒸馏水进行超声提取1h，完成后将提取液进行过滤，再将滤渣重复提取1 次，将两次滤液进行合并待用。③酶解提取（M）：依据文献[4]取黄芪粉5g，加入30ml pH 值为4.5 的磷酸缓冲液，加入纤维素酶0.05g，充分摇匀后60℃下水浴3h，过滤后将滤渣重复提取。④亚临界提取（Y）：称取黄芪粉8g，在高温高压环境下加蒸馏水300ml，密封后将氮气接入5min，高温条件下提取30min，将提取液过滤后再将滤渣进行重复提取，最后将两次滤液进行合并。

1.2.2 联合提取 ①超声辅助联合亚临界提取（C ＋Y）：首先在超声条件下进行提取，完成后再在亚临界提取条件下进行成分提取。②酶解联合亚临界提取（M ＋Y）：首先在酶解条件下进行提取，提取完成后再利用亚临界条件进行成分提取。③水磨联合亚临界提取（S ＋Y）：首先在水磨条件下进行提取，提取完成后再在亚临界条件下进行成分提取。

1.3 黄芪提取物检测

1.3.1 黄芪总皂苷 用等量正丁醇将提取液进行提取，共3 次，在与正丁醇液联合后，使用饱和氨溶液清洗3 次，正丁醇饱和水溶液清洗3 次，去掉正丁醇后将剩余残渣用甲醇定容，取得样品黄芪总皂苷。依据文献[5]使用香草醛-高氯酸比色法检测黄芪总皂苷总提取率，总皂苷提取率=提取液中总皂苷含量/原料质量×100%。

1.3.2 黄芪总黄酮 将20ml 提取液转移到100ml 的分液漏斗中，添加20ml 水饱和正丁醇，摇匀后提取，共3 次，正丁醇液结合后将溶剂蒸发，取残渣用甲醇溶解后定容，依据文献[5]采用氯化铝-亚硝酸钠比色法测定黄芪总黄酮提取率。总黄酮提取率=提取液中总黄酮含量/原料质量×100%。

1.3.3 黄芪多糖 取5ml 提取液放置在10ml 离心管内，放入3ml 无水乙醇，震荡后冷藏12h，离心，取沉淀无水乙醇5ml，清洗后离心，沉淀加蒸馏水溶解，放在容量瓶内定容，取得样品，依据文献[6]采用苯酚-硫酸比色法测定黄芪多糖提取率，多糖提取率=提取液中多糖含量/原料质量×100%。

1.4 黄芪提取物抗氧化能力检测取DPPH 自由基清除力定容后的提取物2ml 及0.2mmol/L DPPH 溶液2ml，混合后摇匀，20min 后500nm 波长检测吸光度值Ai，0.2mmol/L DPPH 溶液2ml 和2ml 90% 乙醇溶液混匀后的吸光度Aj，分别检测2ml 提取物和90%乙醇混合后的吸光度Ac，共计3 次，其中清除率SR（%）=[1-（Ai-Aj）/Ac]×100%；ABTS+自由基清除力和铁离子还原能力检测依据文献[7]，结果以每克干物质中Vc 的含量表示。

1.5 统计学方法采用GraphPadPrism 8.0 软件进行统计分析，计量资料采用±s表示，多组间比较用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，P<0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各提取方法的黄芪总皂苷提取率比较在各提取方法中，黄芪总皂苷的提取率由高到低依次为C＋Y、M ＋Y、C、Y、S ＋Y、S、M，差异具有统计学意义（P<0.05），见表1。

表1 各提取方法的黄芪总皂苷提取率比较（±s，%）

表1 各提取方法的黄芪总皂苷提取率比较（±s，%）

注：与S 比较*P<0.05；与C 比较#P<0.05；与M 比较&P<0.05；与Y 比较%P<0.05；与C ＋Y 比较@P<0.05；与M ＋

提取方法提取率水磨提取（S）0.96±0.15超声辅助提取（C） 2.59±0.98*酶解提取（M） 0.52±0.07*#亚临界提取（Y） 1.82±0.25*#&超声联合亚临界提取（C ＋Y） 4.86±2.38*#&%酶解联合亚临界提取（M ＋Y） 3.65±1.96*#&%@水磨联合亚临界提取（S ＋Y） 1.40±0.50*#&%@￥F 5.119 P 0.001

2.2 各提取方法的黄芪总黄酮提取率比较在各提取方法中，黄芪总黄酮的提取率由高到低依次为S、C ＋Y、M ＋Y、M、Y、C、S ＋Y，差异具有统计学意义（P<0.05），见表2。

表2 各提取方法的黄芪总黄酮提取率比较（±s，%）

表2 各提取方法的黄芪总黄酮提取率比较（±s，%）

注：与S 比较*P<0.05；与C 比较#P<0.05；与M 比较&P<0.05；与Y 比较%P<0.05；与C ＋Y 比较@P<0.05；与M ＋Y 比较￥P<0.05

提取方法提取率水磨提取（S）4.88±2.26超声辅助提取（C） 0.43±0.19*酶解提取（M） 1.75±0.82*#亚临界提取（Y） 0.83±0.36*#&超声联合亚临界提取（C ＋Y） 3.63±1.62*#&%酶解联合亚临界提取（M ＋Y） 2.58±1.20*#&%@水磨联合亚临界提取（S ＋Y） 0.28±0.08*#&%@￥F 6.205 P 0.001

2.3 各提取方法的黄芪多糖提取率比较在各提取方法中，黄芪多糖的提取率由高到低依次为M、S＋Y、C ＋Y、S、M ＋Y、Y、C，差异具有统计学意义（P<0.05），见表3。

表3 各提取方法的黄芪多糖提取率比较（±s，%）

表3 各提取方法的黄芪多糖提取率比较（±s，%）

注：与S 比较*P<0.05；与C 比较#P<0.05；与M 比较&P<0.05；与Y 比较%P<0.05；与C ＋Y 比较@P<0.05；与M ＋Y 比较￥P<0.05

提取方法提取率水磨提取（S）4.59±0.60超声辅助提取（C） 1.23±0.09*酶解提取（M） 6.95±1.33*#亚临界提取（Y） 2.69±0.20*#&超声联合亚临界提取（C ＋Y） 4.80±0.72*#&%酶解联合亚临界提取（M ＋Y） 3.73±0.39*#&%@水磨联合亚临界提取（S ＋Y） 5.78±1.20*#&%@￥F 17.510 P 0.001

2.4 各提取方法的黄芪抗氧化性比较各提取方法的黄芪水提物对DPPH、ABTS+自由基清除力以及铁离子还原能力由高到低依次为M ＋Y、Y、C ＋Y、S ＋Y、S、C、M，差异具有统计学意义（P<0.05），见表4。Y 比较￥P<0.05

表4 各提取方法的黄芪抗氧化性比较（±s，mgVc/g）

表4 各提取方法的黄芪抗氧化性比较（±s，mgVc/g）

注：与S 比较*P<0.05；与C 比较#P<0.05；与M 比较&P<0.05；与Y 比较%P<0.05；与C ＋Y 比较@P<0.05；与M ＋Y 比较￥P<0.05

提取方法DPPHABTS+铁离子还原能力水磨提取（S）20.57±1.887.45±1.2021.80±5.35超声辅助提取（C） 9.62±1.12* 4.67±0.62* 10.98±1.40*酶解提取（M） 5.05±0.38*# 2.12±0.10*# 4.20±0.17*#亚临界提取（Y） 59.32±4.70*#& 30.66±4.65*#& 185.89±23.89*#&超声联合亚临界提取（C ＋Y） 45.45±3.69*#&% 21.75±3.70*#&% 153.69±16.67*#&%酶解联合亚临界提取（M ＋Y） 71.69±5.69*#&%@ 41.89±5.59*#&%@ 224.89±32.25*#&%@水磨联合亚临界提取（S ＋Y） 31.22±2.79*#&%@￥ 12.65±2.69*#&%@￥ 74.05±9.72*#&%@￥F 15.8206.5096.187 P 0.0010.0010.001

3 讨论

多项研究表明，黄芪含有黄酮类、苷类、多糖类等多种化学成分，同时其化学组成复杂且药理学作用广泛，在临床中有着极为广阔的应用前景[8]。本研究各类提取方法在黄芪总皂苷取得情况的结果显示，在单一提取方式中，使用超声辅助法提取的含量较高，亚临界法次之，而酶解法的提取率最低。分析原因，可能是由于黄芪总皂苷的稳定性较好，当进行超声辅助提取时，由于超声波产生的热效应及空化反应可在一定程度上对黄芪的细胞壁结构造成破坏，进而增加了化合物的快速溶出率。而当采用亚临界法提取时，由于温度较高且压力较大，在这一状态下使得提取的水分子极性强烈缩减，导致热动力学提高，最终增加了有效成分的提取率。而在联合提取中，亚临界和超声联合法的提取率最高，亚临界和水磨联合法的提取率最低，分析原因可能是由于超声波在工作中能够产生一定的纤维素酶并同时伴随发生空化反应，而这种反应可与提取物细胞壁所产生的降解反应产生作用，因此，在多种因素的共同作用下使得黄芪的细胞结构彻底被破坏，使皂苷大量溶解并滤出。

本研究在黄芪总黄酮的提取中发现，水磨法的提取率最高，大约是其他提取方法的2 倍以上，分析原因可能为，在进行水磨法提取时，由于提取中是仅仅对于原材料本身产生作用，且在促进黄酮类化合物滤出的同时并不会造成其他因子的破坏，因而极大地提高了提取率及提取纯度。而在单一提取方式里，纤维素酶能够在一定程度上对植物的细胞壁结构进行破坏，进而促进了植物活性成分的大量滤出，酶解提取法的取得率次之。而与单一的提取方式相比，联合提取法在总黄酮提取率上的优势并不显著，原因是由于黄酮类物质稳定性较差，且在高温状态下容易产生分解反应，因此，在进行联合提取时对黄酮的提取率相对较低。

本研究在黄芪多糖提取中发现，酶解提取法对黄芪多糖的提取率中最高，而超声辅助提取法的提取率最低，可能是在超声环境下，长期的超声干预导致多糖因子的结构发生进行性破坏，从而促进了多糖的提取率[9]。且有研究表示，经纤维素酶干预后，黄芪多糖可在质量分数不发生改变的情况下增加提取率[10]。这一结果与本研究相类似。超声与亚临界共同提取法所取得的多糖更多，分析原因可能为当进行联合提取时，能缩短提取时间以及增加提取效率，也从一定程度上避免了黄芪多糖由于环境因素而发生降解反应。另有学者在利用超声联合提取法对植物多糖进行提取的研究中发现，由于超声的共同作用，能够更明显地改变单糖的形态结构及组成，并显著增加多糖的提取率[11]。

据报道，多种病理及生理学表征均与自由基的产生有一定相关性[12]。由于黄芪具有一定的抗氧化效用，分析其抗氧化活性可为黄芪在临床治疗及药物干预中的具体作用机制提供更加准确的方向。经研究，DPPH 自由基性质较为稳定，可以被抗氧化剂和一些能够提供质子等相关因子的清除剂消除，并使其吸光度下降[13]。本研究在DPPH、ABTS+自由基清除率和铁离子还原能力对黄芪水提物抗氧化能性的检测中发现，不同提取方法得到的黄芪提取液对DPPH、ABTS+自由基清除力和铁离子还原能力均能够表现出相同的趋势，即亚临界与其他方法联合提取或者单独采用亚临界法进行提取时，体外的抗氧化能力均较强，其中以酶解联合亚临界提取法的抗氧化能力最强。可见，不同的提取方法对黄芪的抗氧化性可能产生不同程度的影响。分析原因可能为，黄芪中含有较为丰富的氨基酸和还原性糖类，而氧化反应发生时会导致物质本身的状态产生改变，不会产生大量新生的活性物质，这些物质在一定程度上为氧化反应提供了必需的羰基和氨基化合物，进一步参与氧化反应[14，15]。所以这些物质极有可能比皂苷、多糖、黄酮具有更高的抗氧化活性。

综上所述，超声联合亚临界提取法对黄芪总皂苷的提取率更高，水磨法对黄芪总黄酮的提取率更高，酶解提取法对黄芪多糖的提取率更高。而不同提取法对黄芪的抗氧化能力影响也不同，其中酶解联合亚临界提取法在DPPH、ABTS+自由基清除及铁离子还原能力方面均高于其他提取方法。