响应面法优化柴胡药渣中柴胡皂苷提取工艺

孙立权，滕茂浩，丛勇，罗爱芹

（1.北京理工大学 生命学院，北京 100081；2.北京理工大学 生物与医学工程公共实验中心，北京 100081）

柴胡药用最早记载于《神农本草经》中，在中国应用历史悠久，是常用中药材之一.柴胡味辛、苦，性微寒，归肝、胆、肺经，具有解表和里、疏肝解郁、升举阳气的功效，临床常用于治疗久病发热、阳虚潮热、感冒高热、黄疸肝炎、月经不调等疾病[1].《中华人民共和国药典》收载北柴胡Bupleurum chinense DC.和狭叶柴胡B.scorzonerifolium Willd 的干燥根为中药柴胡的植物来源[2].柴胡中的主要有效成分为柴胡皂苷、挥发油、和多糖等物质[3].

通常，提取挥发油后的柴胡药材作为药渣废物处理.最近研究发现作为废物的柴胡药渣中仍然含有大量的柴胡皂苷[4]，该药渣仍具有较高的利用价值，这为柴胡药材的充分利用提出了新课题.本实验以水蒸气蒸馏提取挥发油后的柴胡药渣为研究对象，深入探索了柴胡药材的综合利用工艺.由于微波辅助提取法与溶剂提取法、超声辅助萃取法、超临界流体萃取法等相比效率更高、提取时间更短，设备操作更简单，适用范围更广泛；因此，本实验采用微波辅助常压加热回流提取柴胡皂苷，研究了甲醇体积百分比、微波提取时间、微波提取温度、料液比与提取率的关系，并用Design-Expert 软件进行响应面实验设计优化工艺参数[5-6]，确定了最佳提取工艺条件，进而为中药提取提供了实验基础.

柴胡皂苷的分析检测在2020 版《中华人民共和国药典》中以柴胡皂苷a 和d 为主[2].也有文献报道，柴胡皂苷a 与b1、柴胡皂苷d 与b2能够在加热提取过程中出现结构转化[7]，因此，本研究把柴胡皂苷a、b1、b2和d 作为提取皂苷指标，其中柴胡皂苷b1的量非常少，对实验结果影响极小，最终以柴胡皂苷a、b2、d 作为定量指标.

1 材料与方法

1.1 实验仪器和材料

BRAVE 高效液相色谱仪（常州磐诺仪器有限公司）；台式连续投料粉碎机（温岭市林大机械有限公司）；MAS-3 微波反应器（上海新仪微波化学科技有限公司）；电子分析天平（上海越平科学仪器制造有限公司）.

柴胡药材由河南利欣制药有限公司提供，经北京理工大学生命学院李玉娟教授鉴定为北柴胡Bupleurum chinenseDC.的干燥根；柴胡药渣为提取柴胡挥发油之后的剩余渣料，也由河南利欣制药有限公司提供；柴胡皂苷a、b2、d 对照品购自成都德斯特生物（HPLC 纯度>98%），甲醇(分析纯)购自北京市通广精细化工公司，乙腈(色谱纯)购自北京伊诺凯科技有限公司；超纯水为自制.

1.2 实验方法

1.2.1 HPLC 色谱条件

Welch ultimate HPLC XB-C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流动相为乙腈（A）和水（B），梯度洗脱（0～15 min：30%→40%A，15～25 min：40%→50%A，25～35 min：50%→100%A，35～38 min：100%A，38～42 min：100%→30%A，42～45 min：30%A）；每次进样前平衡10 min；流速为0.2 mL/min，进样体积为5 μL，柱温为30 °C，检测波长为210 nm.

1.2.2 对照品溶液的制备

精密称定对照品柴胡皂苷a 为 7.8 mg、柴胡皂苷b2为6.0 mg、柴胡皂苷d 为7.8 mg、用 50%甲醇水溶液超声使其溶解，置于10 ml 容量瓶中，并补足至刻度线，即得对照品溶液.对其进行HPLC 检测，以对照品溶液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制标准曲线，各组分在对应浓度范围内的线性关系良好，标准曲线方程见表1.

表1 对照品曲线方程Tab.1 Reference curve equation

1.2.3 样品溶液的制备

精密称取柴胡药渣粉末（过4 号筛）1.00 g，置于250 mL 具塞两口圆底烧瓶中，加入一定体积比的甲醇水溶液适量，将其放入微波加热器中，设置微波提取时间和温度，常压提取.提取完毕后，趁热过滤，用甲醇洗涤抽滤瓶，补足体积，经0.22 μm 微孔滤膜过滤，用HPLC 检测.

1.2.4 总皂苷的定量方法

将样品溶液进行HPLC 分析，得到色谱图，将对相应的柴胡皂苷a、b2、d 的峰面积带入对照品的标准曲线方程中计算相应的浓度c；

柴胡皂苷提取量=c×提取液的体积；

总柴胡皂苷提取量=柴胡皂苷a 提取量+柴胡皂苷b2提取量+柴胡皂苷d 提取量；

总柴胡皂苷得率=(总柴胡皂苷提取量/柴胡药渣样品量)×100%.

1.2.5 单因素提取实验

选择柴胡皂苷提取过程中的4 个工艺参数进行单因素实验.参数分别选择：甲醇体积百分比（50%、60%、70%、80%、90%）、微波提取温度（50 °C、60 °C、70 °C、80 °C、90 °C）、微 波 提 取 时 间（10、20、30、40、50 min）、料液比（1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80 g/mL）.甲醇水溶液的沸点随着甲醇体积百分比的升高而逐渐降低，在甲醇体积百分比为80%甲醇水时沸点为70 °C，且两者之间不共沸，在常压下的设定温度范围内宜采用回流提取.以单因素实验结果为响应面优化实验设计提供数据.

1.2.6 响应面实验设计优化

根据单因素实验结果，以微波提取温度、料液比、提取时间、甲醇体积百分比设计4 因素3 水平的响应面优化实验，每个影响因素选取三个水平分别为微波提取温度：60 °C、70 °C、80 °C，料液比：1∶50、1∶60、1∶70 g/mL，提取时间：20、30、40 min，甲醇体积百分比50%、60%、70%，用-1、0、1 表示，通过回归方程拟合分析最佳提取条件.实验因素水平见表2.

表2 响应面实验设计影响因素和水平Tab.2 Influencing factors and levels of BBD experimental design

1.3 方法学考察

采用加样回收率实验对HPLC 检测方法进行考察.精密称取已知含量的柴胡药渣粉末样品9 份，每份1.00 g，按照“1.2.2”下样品溶液提取方法，采用响应面优化的最佳提取工艺进行提取，每组精密加入柴胡皂苷a、b2、d 对照品的量，计算每组中的柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷d 的加样回收率及其RSD.

1.4 数据处理

对重复3 次实验结果，采用Design-Expert 13.0 软件进行响应面实验设计和分析，采用Microsoft Excel 和Design-Expert 13.0 作图.

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果分析

采用微波辅助加热回流的方式，以甲醇水作为提取溶剂，以柴胡皂苷a、b2、d 总和为指标，进行单因素考察.分析了不同甲醇体积百分比、微波提取时间、提取温度和料液比对柴胡皂苷提取率的影响.

2.1.1 甲醇体积百分比对提取率的影响

在微波提取时间为40 min、提取温度为70 °C、料液比为1∶60 g/mL 的条件下，甲醇体积百分比从50%增加到90%.实验结果表明，当甲醇体积百分比从50%升高到70%时，随着甲醇体积百分比的提高皂苷提取率增加；当甲醇体积百分比超过70%以后，皂苷提取率随着甲醇体积百分比提高而下降；提取液的沸点随着甲醇体积百分比的改变而改变，在常压70 °C 下浓度为70%、80%、90%的甲醇水溶液已经沸腾，而50%、60%浓度的甲醇溶液还没有沸腾，因此提取效果不佳；实验数据显示在70%甲醇水体积百分比下的皂苷提取率最大，因此选择70%的甲醇体积百分比.

2.1.2 微波提取温度对提取率的影响

在甲醇体积百分比为70%、料液比为1:60g/mL、微波提取时间为40 min 的条件下，微波提取温度从50 °C 上升到90 °C.实验结果表明，当提取温度从50 °C上升到70 °C 时，随着微波提取温度的上升皂苷提取率上升，当温度高于70 °C 之后，随着微波提取温度的上升皂苷提取率开始下降.温度作为影响渗透的一个重要参数，它影响细胞膜的渗透性，使溶质通过失去选择性而渗透.随着温度的升高，分子运动加快，促进了皂苷的提取；而在70 °C 之后随着温度的升高会导致部分柴胡皂苷a 和d 的分解导致提取率的下降降[8].因此，选择70 °C 的微波提取温度条件.

2.1.3 提取时间对提取率的影响

在甲醇体积百分比为70%、料液比为1∶60 g/mL、微波提取温度为70 °C 的条件下，随着提取时间从10 min 延长到50 min.实验结果表明，当提取时间从10 min 延长到30 min 时，柴胡皂苷提取率逐步上升，在30 min 皂苷提取率最大，继续延长时间，皂苷提取率开始下降.提取时间的延长，一方面通过增大细胞的破碎程度、细胞膜膨胀和塑化来提高提取率，另一方面随着提取时间的延长，长期处于高温环境中的皂苷会发生部分的分解和转化[8]，当延长到一定时间后提取率会下降.因此，选用30 min 为提取时间.

2.1.4 料液比对提取率的影响

在甲醇体积百分比为70%、微波提取温度为70 °C、提取时间为30 min 的条件下，随着料液比从1∶40 g/mL改变到1∶80 g/mL.实验结果表明，当料液比从1∶40 g/mL 改变到1∶60 g/mL，柴胡皂苷的提取率逐渐上升，当料液比低于1∶60 g/mL 时，料液比增加但提取率降低；柴胡皂苷有最大的溶解量，当料液比增加，柴胡皂苷的溶解量不变，同时柴胡中的杂质溶解量增大，导致皂苷提取率下降[9].因此料液比选择为1∶60 g/mL.

2.2 响应面实验设计优化结果分析

2.2.1 响应面实验结果

在单因素实验的基础上，应用Design-Expert 13.0软件，采用响应面实验设计优化皂苷提取实验条件.以柴胡皂苷提取率为响应值，共设计4 因素3 水平实验29 组，设计见表3.

表3 响应面实验结果Tab.3 Results of response surface test

2.2.2 数学模型拟合及数据分析

用Design-Expert 13.0 软件对上述实验结果进行分析，采用Quadratic 模型对实验数据进行多元回归拟合，得到柴胡皂苷提取率的回归方程为

式中：Y为柴胡皂苷提取率；A为微波提取温度；B为料液比；C为提取时间；D为甲醇体积百分比度，实验方差分析结果见表4.

以皂苷提取率作为响应值，利用响应面实验设计中的ANOVA 实验数据进行统计分析，研究模型系数在一阶、二阶和交互模型之间的拟合度和显著性(表4)，模型的p<0.000 1(p<0.01)表示模型具有统计学显著性.对模型进行评估，相关系数R2=0.975 4，调整确定系数R2adj=0.948 9，均接近于1，表明数据对回归模型具有很高的拟合度[10]；该模型具有合理性.失拟项的p=0.554 8(>0.05)，影响不显著，表明该回归模型可以很好地预测实验结果.

表4 实验方差分析结果Tab.4 Results of experimental analysis of variance

2.2.3 响应面结果分析

利用Design-Expert 13.0 软件进行多元拟合得出响应面图和对应的等高线图.固定其他因素水平值观察各因素间的交互作用对柴胡中皂苷提取率的影响结果.等高线的形状和曲面图中的陡峭程度可反映出2 个因素之间的交互作用对响应值影响的显著性与否.由图1 可知，在响应面图中，曲面变化陡峭，斜率极大，且等高线图中曲线图为椭圆，皂苷提取率变化极为明显[11]；因此微波提取温度和提取时间的交互作用显著.由图2 可知，在响应面图中，曲面变化陡峭，斜率极大，且等高线图中的曲线为椭圆，皂苷提取率变化极为明显，甲醇水溶液的沸点随着甲醇体积百分比的上升逐渐降低，两者之间的相互作用明显[12]，因此微波提取温度和甲醇体积百分比的交互作用显著.由图3可知，在响应面图中，曲面变化陡峭，斜率较大，且等高线图中的曲线为椭圆，皂苷提取率变化较为明显[13]，微波提取温度和甲醇体积百分比的交互作用较为显著.

图1 微波提取温度和提取时间对对皂苷提取率影响Fig.1 Effect of the microwave extraction temperature and extraction time on extraction yield of saikosaponins

图2 微波提取温度和甲醇体积百分比对皂苷提取率影响的响应面和等高面图Fig.2 Effect of the microwave extraction temperature and methanol concentration on extraction yield of saikosaponins

图3 微波提取温度和料液比对皂苷提取率影响Fig.3 Effect of the microwave extraction temperature and solid-liquid ratio on extraction yield of saikosaponins

由图4 可知，在响应面图中，曲面变化较为陡峭，斜率较大，等高线图中的曲线为椭圆，但接近为圆，柴胡皂苷提取率变化不明显[13]，微波提取温度和甲醇体积百分比的交互作用不显著.由图5 可知，在响应面图中，曲面变化较缓，等高线图中的曲线为椭圆，但接近为圆，柴胡皂苷提取率变化不明显，微波提取温度和甲醇体积百分比的交互作用不显著.由图6可知，在响应面图中，曲面变化较陡峭，但等高线图中的曲线接近为圆，皂苷提取率变化不明显，提取时间和甲醇体积百分比的交互作用不显著.

图4 料液比和甲醇体积百分比对皂苷提取率影响Fig.4 Effect of the solid-liquid ratio and methanol concentration on extraction yield of saikosaponins

图5 料液比和提取时间对皂苷提取率影响Fig.5 Effect of the solid-liquid ratio and extraction time on extraction yield of saikosaponins

图6 提取时间和甲醇体积百分比对皂苷提取率影响Fig.6 Effect of extraction time and methanol concentration on extraction yield of saikosaponins

此外，A、D、AC、AD、A2、B2、C2、D2的p<0.01 达到极显著水平，表明提取温度、甲醇体积百分比单一作用和微波提取温度与提取时间交互作用、微波提取温度和甲醇体积百分比的交互作用对柴胡皂苷提取率影响极显著，B、AB的p<0.05 达到显著水平，表明料液比的单一作用和提取温度与料液比的交互作用对响应值的影响较大，C、BC、BD、CD的p>0.05不显著，对柴胡皂苷提取率的影响较小[14].由此可得出单因素对响应值影响大小的顺序为A>D>B>C.

2.3 方法学考察

加样回收率实验对HPLC 检测方法进行方法学考察，计算每组中的柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷d 的加样回收率及其RSD，结果如表5～7 所示.柴胡皂苷a 加样回收率结果中RSD 为1.55%;柴胡皂苷b2加样回收率结果中RSD 为0.53%;柴胡皂苷d 加样回收率结果中RSD 为1.21%.

表5 柴胡皂苷a 加样回收率结果(n=9)Tab.5 Average recovery of Saikosaponin a at three different levels( n= 9)

表6 柴胡皂苷b2 加样回收率结果Tab.6 Average recovery of Saikosaponin b2 at three different levels

表7 柴胡皂苷d 加样回收率结果Tab.7 Average recovery of Saikosaponin d at three different levels

结果显示检测方法中3 种皂苷的回收率在97.52%～100.80%，RSD 均小于1.55%，表明该方法的准确性良好，该检测方法可作为检测柴胡皂苷的含量测定方法.

2.4 工艺条件优化结果

通过对微波提取温度、料液比、提取时间和甲醇体积百分比4 个因素的工艺参数的优化，得到最佳参数结果：微波提取温度为68.4 °C、料液比为1∶59 g/mL、提取时间为30.2 min、甲醇体积百分比为60.4%.最终选择微波提取温度为68 °C、料液比为1:59 g/mL、提取时间为30 min、甲醇体积百分比为60%，作为实际实验选择.

2.5 验证实验

甲醇水溶液微波辅助提取1 g 柴胡药渣，用HPLC分析得到的提取液得到柴胡皂苷的提取率列于表8.采用“2.4”项下优化的工艺参数进行5 次验证实验，柴胡药渣中的皂苷提取量分别为5.182、5.164、5.24、5.135、5.152 mg/g，平均皂苷提取率为5.175 mg/g，RSD为0.78%，与预测值5.141 mg/g 相接近，重复性良好.实验结果表明工艺参数可靠.

表8 提取物质量及皂苷占比Tab.8 Extract amounts and their ratios of every saikosaponin

2.6 HPLC 检测色谱图

按照“1.2.2”项下HPLC 检测方法对供试品溶液及对照品溶液进行检测，并按照保留时间和特征峰进行比对，得到样品溶液中每个相应物质的峰位置，色谱图见图7.

图7 供试品溶液及柴胡皂苷a、b2、d 对照品HPLC 图Fig.7 HPLC diagrams of sample solution, Bupleurum saponin a, b2 and d

3 结 论

本研究采用单因素实验筛选了微波提取温度、料液比、提取时间、甲醇体积百分比等4 个因素作为响应面设计优化的因素，优化的结果表明设计的模型具有显著性.得出用甲醇水溶液作为提取溶剂的最佳工艺参数为：微波提取温度为68 °C、料液比为1∶59 g/mL、提取时间为30 min、甲醇体积百分比为60%.统计回归分析表明，该工艺参数可作为进一步开展中试研究的参考，对扩大生产规模有一定的指导意义.