2种野生银莲花种子休眠与萌发特性探析

逯锦春,王铁军,朱玉菲,吴萌,王金鑫,陈新娜,李彦慧

(1 河北农业大学 园林与旅游学院,河北 保定 071000;2 河北省林业和草原局宣传中心,河北 石家庄 050000)

河北省自然地理条件优越,野生花卉资源丰富,市场潜力巨大。长毛银莲花(Anemonenarcissifloravar.Crinita)与银莲花(Anemonecathayensis)同属于毛茛科、银莲花属,具有较高的观赏及药用价值。自然条件下银莲花属植物主要依靠根茎进行繁殖,繁殖速度较慢,难以满足在园林应用及药用生产上的需求[1-5]。目前,有关银莲花的研究报道多集中在植物化学成分与药理研究方面,涉及2种野生银莲花种子萌发方面的研究尚无报道。随着对野生资源需求的不断增加,研究其种子萌发对实现大批量人工栽培具有重要意义。

种子繁殖是目前解决野生植物资源短缺的有效方法,但受自然环境条件及人为条件限制,野生银莲花资源有限,且在自然条件下种子存在休眠现象,大大限制了其植物资源利用。在对同属植物野生林荫银莲花(Anemoneflaccida)种苗繁殖技术研究中,采用了多种措施处理,种子均难以萌发,说明该种子存在严重休眠现象[6-7]。种子休眠是制约野生银莲花大规模栽培的瓶颈问题,因此寻找适宜的萌发条件至关重要。本研究以2种野生银莲花种子为试验材料,采用正交试验的设计方法测定种子活力,通过研究不同培养温度、不同浓度赤霉素处理、浓硫酸浸种、不同层积处理方式对种子萌发的影响,探讨种子休眠原因与休眠类型,筛选适宜的萌发条件,这对保护与开发河北省野生银莲花资源并扩大其园林应用范围具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料于2018年9月中旬采摘,长毛银莲花种子采自河北省承德塞罕坝机械林场(E 116°53′～117°39′,N 41°92′～42°36′),银莲花种子采自雾灵山自然保护区,自然干燥后贮藏于4 ℃冰箱中。

1.2 试验方法

1.2.1 种子基本参数测定 主要包括外形、千粒重、种子吸水率测定。参考刘长江对植物种子形态学的描述方法,观察并描述2种野生银莲花种子形态特征,随机选取50粒颜色相同的饱满种子,用数显式游标卡尺测量种子的长度和宽度,并计算长宽比,取平均值[8]。采用千粒法随机数取1 000粒种子进行测量,重复3次。选取50粒颜色相同且饱满的种子进行吸水能力的测试,加入蒸馏水浸没种子,每隔12 h捞出种子,用吸水纸吸干表面水分在电子天平上称重,直至种子重量不再变化为止,计算其最大吸水率,重复3次。

1.2.2 种子活力测定 选择颜色相同且饱满一致的种子,去除外种皮,用手术刀将种子沿中央纵切,取出完整种胚。采用氯化三苯基四氮唑染色法(简称TTC法)进行种子活力测定。通过正交试验的设计方法观察在不同染色温度、染色时间和TTC浓度下2种野生银莲花种子的活力,种胚被染上红色即视为有活力。每个染色因素下均设3个水平,共9个处理,每处理下种子数量为36粒,设3次重复。具体因素水平设定见表1。

表1 银莲花种子活力测定正交设计处理Table 1 Orthogonal design for determination of seed vigor of A. cathayensis

1.2.3 种子萌发试验 (1)温度处理：将2种野生银莲花种子浸种48 h,10%的H2O2消毒15 min后用蒸馏水冲洗干净备用,向培养皿内铺2层定性滤纸,于15、20、25、30 ℃的恒温光照培养箱下进行培养,光照强度2 500 lx,光照12 h/黑暗12 h。每天根据滤纸干燥程度进行适当补水,保持湿润状态,观察记录发芽数。每个处理25粒种子,3次重复。

(2)赤霉素处理：采用不同浓度 GA3进行处理,GA3设置5个处理,浓度分别为0、50、100、200、400 mg/L。每个处理25粒种子,3次重复。将2种银莲花种子在各浓度GA3溶液中浸泡48 h,于20 ℃光照培养箱中进行培养,其他培养条件同1.4.1。

(3)浓硫酸浸种处理：采用98%浓硫酸分别浸泡2种银莲花的种子0、2、4、8 min,酸处理后将种子冲洗干净,于20 ℃光照培养箱中进行培养,其他培养条件同1.4.1。每个处理25粒种子,3次重复。

(4)恒温层积处理：将沙子经筛子过筛,去除多余杂质,加入适量蒸馏水拌匀,沙子的湿度以手握成团松开即散为宜。挑选2种野生种子各900粒,将沙子与种子按3∶1的比例混匀,分装到扎孔的培养袋中,置于4 ℃恒温冰箱中层积,分别层积30、60、100 d,并于100 d后转至室温15、30 d,定期观察并记录发芽数。

(5)地窖层积处理：在装有种子的扎孔培养袋四周填满沙子,放于地窖内进行层积处理,其他同上。将2种种子分别层积60、100 d、并于100 d后转至室温15、30 d。当种子连续15 d不再萌发时试验结束。观察统计不同时段下的发芽种子数,计算发芽率(种子萌发以胚根露白为统计标准)。具体处理见表2。

表2 层积处理设计Table 2 Design of stratification treatment

1.2.4 指标测定

最大吸水率(%)=(吸足水后的重量-吸水前的重量)/吸水前的重量 × 100%

(1)

千粒重(g)=(种子重量/种子粒数)× 1 000

(2)

种子生活力(%)=(有生活力的种子数/试验种子总数)× 100%

(3)

1.2.5 数据处理 试验数据用Excel软件进行记录处理, 使用SPSS 20.0软件进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 种子基本参数测定

2种野生银莲花种子的基本参数,见表3。

由表3可知,2种野生银莲花种子皆为瘦果,呈椭圆形,表面略粗糙,无毛,两侧具翅。长毛银莲花种子颜色为浅褐色,种子长度为8.19 mm,宽度为5.35 mm,长宽比为1.53,最大吸水率为122.00%;银莲花种子颜色为棕黑色,种子长度为7.37 mm,宽度为4.81 mm,长宽比为1.55,最大吸水率为123.00%。种子千粒重是衡量种子饱满程度的一个重要指标,千粒重越大表明种子越饱满。银莲花种子的千粒重比长毛银莲花种子高2.74 g。

2.2 种子活力测定

TTC染色法是国际上判断种子活力及发芽潜力的常用方法。2种野生银莲花种子活力测定正交试验结果,见表4。

表4 野生银莲花种子活力测定正交试验结果Table 4 Orthogonal test results for determination of seed vigor of A. cathayensis

由表4可知,2种银莲花种子在不同处理下种子活力不同。长毛银莲花种子活力最高的组合为处理5,活力最高为74.97%,染色温度25 ℃,染色时间12 h,TTC浓度1.00%,比最低组合处理2高出31.5%,且与其他处理均呈显著差异;银莲花种子活力最高的组合为处理7,种子活力最高为83.33%,染色温度30 ℃,染色时间6 h,TTC浓度1.00%,活力最低的组合为处理8,最高处理比最低处理高33.15%。

对正交处理结果进行方差分析,见表5。

表5 方差分析结果Table 5 Results of variance analysis

由表5可知,3个因素对2种野生银莲花种子染色的影响。对于长毛银莲花种子,染色温度的P值为0.001,小于0.05,表明在0.05水平下,染色温度对长毛银莲花种子的染色效果影响显著;而对于银莲花种子,染色温度与TTC浓度的P值均小于0.05,说明这2个因素对银莲花种子的染色影响显著。根据P值与F值可知,影响长毛银莲花种子染色效果大小顺序为：染色温度>染色时间>TTC浓度;而影响银莲花种子染色效果大小顺序为：TTC浓度>染色温度>染色时间。

2.3 种子萌发特性

2.3.1 不同温度、赤霉素浓度、浓硫酸浸种处理对种子萌发的影响 对未经过层积的2种银莲花种子进行不同温度、赤霉素浓度、浓硫酸浸种处理,见表6。

表6 不同处理方式下2种银莲花种子的发芽率Table 6 Germination rate of two A. cathayensis seeds under different treatments

由表6可知,各处理水平之间均不存在显著差异,且2种银莲花种子发芽率均较低。在98%浓硫酸浸种8 min处理下,银莲花种子表面出现干瘪,内部结构受损,不再吸水,种子失活,发芽率为0。在3种处理方式下,长毛银莲花的种子平均发芽率总计为3.79%,银莲花种子平均发芽率总计为2.77%。在试验中发现,2种野生银莲花种子萌发时滞较长,分别为42、45 d。

2.3.2 不同层积处理对种子萌发的影响 不同层积处理下2种银莲花种子的发芽率,见表7。

表7 不同层积处理下银莲花种子的发芽率Table 7 Germination rate of A. cathayensis seeds under different stratification treatments

由表7可知,在2种不同层积处理方式下,层积100 d+转室温30 d后2种银莲花种子均不再萌发,发芽率为0,至此发芽试验结束,因此未列入表中。在同一层积方式下,银莲花种子的发芽率随层积时间的增加逐渐升高。对比4 ℃层积与地窖层积处理可知,与层积100 d相比,层积100 d+室温15 d能够显著提高2种银莲花种子的发芽率,长毛银莲花种子发芽率分别提高了10.00%、18.22%;银莲花种子发芽率提高了6.67%、11.79%,且均显著高于其他层积时间段,说明室温变温处理显著提高了种子发芽率。通过2种层积处理方式可知,长毛银莲花和银莲花种子的最适宜萌发条件为地窖层积100 d+室温15 d处理,发芽率分别为34.44%和45.78%。

3 讨论与结论

3.1 讨论

3.1.1 野生银莲花种子休眠原因及类型 对种子进行生物学特性研究是初步判断种子质量的关键性工作,通常因外界环境因子与植物内部遗传因素的不同会产生不同大小的种子[9]。TTC染色法法是生产实践上一种常用来分析与判断种子发芽能力的方法。大量研究表明,TTC法测定种子活力的结果一般大于或等于其发芽率[10]。种子休眠是自然界中一种较为普遍的现象,是指种子具有活力而不萌发的现象,这是植物在长期进化过程中为抵抗外界不良环境条件形成的一种应激反应。通常影响种子休眠的主要因素有温度、光照、水分、自身原因等,种子休眠可分为物理休眠、形态休眠、生理休眠、形态生理休眠与复合休眠5种类型,休眠类型直接决定种子发芽难易[11-12]。

本研究测定2种野生银莲花种子活力最高分别为74.97%、83.33%,而种子发芽率最高可达34.44%、45.78%,种子活力高于发芽率。在试验中尝试用浓硫酸浸种打破其休眠,但其种子可正常吸水及发芽,说明种皮不是造成休眠的主要原因,即不存在物理休眠;在不同温度与赤霉素处理下,发现2种野生银莲花种子发芽率都较低,无显著差异,而且在萌发过程中未发现萌发高峰,无发芽势,这与山东银莲花(A.chosenicolavar.schantungensis)种子的研究结果一致[13-14]。在试验前期观察2种银莲花种子发现种胚皆发育不成熟,仍处于心形胚时期。目前根据2种野生银莲花种子萌发过程中需要先经过低温层积促使种胚完成生理后熟,获得萌发能力后才能萌发的特性,将其初步归类为形态生理休眠,这是其种子休眠的主要原因[15]。

3.1.2 变温层积对休眠种子萌发的影响 种子在萌发过程中大量酶会发生活化反应来调节种子内部机制的物质转化与能量运输,温度作为影响酶活性的一个主要因素,在参与种子萌发过程中起着重要的作用[16]。变温层积是打破形态生理休眠的一种常用方式,适当的变温处理对于一些具有活力而存在严重休眠的种子具有一定的促进萌发作用,因此掌握适宜种子萌发的温度尤其重要[17]。

本试验中,在2种层积处理方式下,随层积时间的增加,种子发芽率逐渐升高,说明在层积过程中,种子的休眠逐渐解除,但随着层积时间超过115 d时,种子停止萌发且大量发霉,也说明在层积过程中要严格控制层积时间。2种野生花种子在层积100 d后进行室温变温层积,种子发芽率显著提高,说明变温层积可以有效打破种子休眠,促进种子发芽。

3.2 结论

长毛银莲花种子在染色温度25 ℃,染色时间12 h,TTC浓度为1.00%条件下,活力最高为74.97%;而银莲花种子活力最高的处理组合为染色温度30 ℃,染色时间6 h,TTC浓度1.00%,种子活力最高为83.33%。对种子活力正交处理结果进行方差分析得出,影响长毛银莲花种子染色效果大小顺序为：染色温度>染色时间>TTC浓度,而影响银莲花种子染色效果顺序为：TTC浓度>染色温度>染色时间。对2种银莲花种子进行不同温度、GA3浓度及浓硫酸浸种处理,发现2种野生银莲花种子发芽率皆较低。在4 ℃层积与地窖层积2种处理方式下,2种银莲花种子发芽率显著提高,并得出长毛银莲花和银莲花种子的最适宜萌发条件为地窖层积100 d+室温15 d处理,发芽率分别可达34.44%和45.78%。