基于网络药理学及分子对接探究党参治疗射血分数保留性心力衰竭的分子机制

纪 翔,林 谦,徐江林,周 鹍,刘 静,逯金金,高 群

射血分数保留性心力衰竭(heart failure with preserved ejection fraction,HFpEF)又称舒张性心力衰竭(diastolic heart failure,DHF),其病理机制与舒张期心室主动松弛性和被动顺应性受损有关[1]。《中国心血管健康与疾病报告2019概要》[2]指出,我国约有890万例心力衰竭病人,其中接近50%的心力衰竭病人是射血分数保留性心力衰竭。射血分数保留性心力衰竭病人生活质量下降,发病率、死亡率高,给社会、经济带来巨大负担[3]。但是射血分数保留性心力衰竭的发病机制、有效治疗尚未明确,是目前心力衰竭研究的难点[4]。中医学认为,射血分数保留性心力衰竭病机以“气虚为本”,党参(DS)是补气的代表药物之一,在慢性心力衰竭的治疗中能有效地改善病人的症状,提高病人的生活质量。现代药理研究表明,党参具有保护心肌细胞、改善心肌能量代谢、抗心肌细胞氧化、改善心功能、抗凝等作用[5-6]。但是目前党参对射血分数保留性心力衰竭的作用机制尚不清楚。网络药理学是一种新兴的药物研究方法,可以全面、系统地探索药物与疾病的关系,为研究中药复杂的分子机制提供了有力的工具[7]。本研究将基于网络药理学研究党参对射血分数保留性心力衰竭的分子机制。

1 资料与方法

1.1 党参有效成分筛选及潜在靶点预测 通过中药系统药理学数据库和分析平台(Traditional Chinese Medicine System Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP,http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)[8]检索党参的活性成分。设置口服生物利用度(oral bioavailability,OB)>30%、化合物类药性(drug-likeness,DL)>0.18。将有效成分2D结构导入Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)[9]数据库,预测党参潜在靶点。

1.2 射血分数保留性心力衰竭相关靶点的收集 以射血分数保留性心力衰竭和舒张性心力衰竭为关键词,分别检索DisGeNET(http://www.disgenet.org/)和GeneCards(https://www.genecards.org/)[10-11]数据库,获取射血分数保留性心力衰竭相关靶点。

1.3 党参治疗射血分数保留性心力衰竭的共同靶点 通过在线软件作图工具Interacti Venn构建韦恩图,获得党参-射血分数保留性心力衰竭的共同靶点。

1.4 党参-有效成分-潜在靶点网络构建 使用Cytoscape 3.7.2软件,构建“党参-有效成分-潜在靶点”网络,党参、有效成分和潜在靶点以“节点”显示,节点间的相互作用以“边”显示。使用Cytoscape软件中的Network Analyzer插件计算Degree值,筛选党参的核心成分。

1.5 蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络构建 将党参-射血分数保留性心力衰竭共同靶点输入STRING数据库(https://string-db.org/)[12],设置置信度>0.7,隐藏网络中无关联的节点,将结果文件保存为tsv格式,导入Cytoscape 3.7.2软件,使用其cytoHubba插件对PPI网络进行分析,筛选党参治疗射血分数保留性心力衰竭的关键靶点。

1.6 基因本体(gene ontology,GO)功能与京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析 将党参-射血分数保留性心力衰竭的共同靶点输入Metascape数据库(http://metascape.org/gp/index.html)[13]进行GO功能与KEGG通路富集分析。GO 功能分析可获得生物学过程、细胞组分和分子功能,用于描述基因靶点的功能;KEGG通路富集分析可获得党参-射血分数保留性心力衰竭共同靶点所富集的信号通路。

1.7 分子对接 将获得的核心成分与关键靶点进行分子对接,获得对接亲和力以反映分子间的结合稳固性。使用AutoDockTools进行分子处理,AutoDock Vina软件进行分子对接,PyMol2.4.0进行可视化[14-15]。

2 结 果

2.1 党参的有效成分以及潜在靶点 经过OB、DL筛选以及剔除无靶点成分,共获得党参有效成分16个(见表1)。通过Swiss Target Prediction预测,删除重复值后获得党参的潜在靶点385个。

表1 党参有效成分基本信息

2.2 射血分数保留性心力衰竭相关靶点 以舒张性心力衰竭、射血分数保留性心力衰竭为关键词检索GeneCards和DisGeNET数据库,收集靶点并去除重复值后获得射血分数保留性心力衰竭相关靶点1 001个。

2.3 党参-射血分数保留性心力衰竭共同靶点 将385个党参潜在靶点和1 001个射血分数保留性心力衰竭相关靶点输入在线软件作图工具,绘制韦恩图获得党参-射血分数保留性心力衰竭共同靶点116个。详见图1。

图1 党参-射血分数保留性心力衰竭共同靶点的韦恩图

2.4 党参-有效成分-潜在靶点网络构建及党参核心成分的筛选 将党参的16个有效成分及385个靶点输入Cytoscape 3.7.2软件,获得党参-有效成分-潜在靶点网络(见图2)。使用Network Analyzer插件计算Degree值,Degree值提示成分与作用靶点的关联个数,Degree值越大表明该成分越重要,Degree值排名前3位的成分为党参的核心成分,分别是7-甲氧基-2-甲基异黄酮(7-Methoxy-2-methyl isoflavone,Degree=108)、木犀草素(Luteolin,Degree=105)和11-羟基兰金断肠草碱(11-Hydroxyrankinidine,Degree=100)。

2.5 PPI网络构建及党参治疗射血分数保留性心力衰竭的关键靶点筛选 将党参-射血分数保留性心力衰竭共同靶点输入STRING数据库,设置置信度>0.7获得PPI网络(见图3)。使用cytoHubba插件根据Degree值对PPI网络进行分析,获得5个党参治疗射血分数保留性心力衰竭的关键靶点,分别是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)1、原癌基因酪氨酸蛋白激酶(SRC)、蛋白激酶B1(AKT1)、MAPK3、表皮生长因子受体(EGFR),详见表2。

图3 党参治疗射血分数保留性心力衰竭的关键靶点筛选(A为党参-射血分数保留性心力衰竭PPI网络图;B为党参治疗射血分数保留性心力衰竭的关键靶点图)

表2 党参治疗射血分数保留性心力衰竭的关键靶点信息

2.6 GO功能和KEGG通路富集分析

2.6.1 GO功能富集分析结果 生物学过程主要集中在:MAPK级联反应的正调控(positive regulation of MAPK cascade),循环系统过程(circulatory system process),激素水平的调节(regulation of hormone levels),调节离子传输(regulation of ion transport),细胞对氮化合物的反应(cellular response to nitrogen compound)等。细胞组分主要集中在膜筏(membrane raft)、受体复合体(receptor complex)、突触前膜的固有成分(intrinsic component of presynaptic membrane)、初级内体(early endosome)和细胞顶端(apical part of cell)等。分子功能主要集中在:肾上腺素受体活性(adrenergic receptor activity),蛋白激酶活性(protein kinase activity),辅因子结合(cofactor binding),激素结合(hormone binding)和激酶结合(kinase binding)等。详见图4～图6。

图4 GO功能富集分析排名前20位的生物学过程

图5 GO功能富集分析排名前20位的细胞组分

图6 GO功能富集分析排名前20位的分子功能

2.6.2 KEGG通路富集分析结果 通路主要富集于癌症(pathways in cancer)、环磷酸鸟苷/蛋白激酶信号通路(cGMP/PKG signaling pathway)、内分泌抵抗(endocrine resistance)、神经活性配体/受体相互作用(neuroactive ligand/receptor interaction)和血清素能突触(serotonergic synapse)等。详见图7。

2.7 分子对接分析 将排名前3位的核心成分与关键靶点进行分子对接,获得的平均对接亲和力为-36.4 kJ/mol(见表3,对接亲和力越小,表明配体与受体蛋白的结合越稳定)。AKT1与11-hydroxyrankinidine分子对接结果最佳(见图8)。

表3 分子对接结果

图8 AKT1与11-Hydroxyrankinidine分子对接模式图

3 讨 论

根据射血分数保留性心力衰竭胸闷、气短、唇紫、下肢水肿等症状体征,可将其归于中医“心悸”“喘证”“水肿”等范畴,病位在心,《内经》有言:“心主血脉”,血液的正常运行需要心气的鼓动,心气不足会致气血运行不畅,瘀血内阻,因此气虚为本贯穿始终,瘀、水为标是该病的主要病机[16]。《本草从新》最早记载了党参的作用:“补中益气,和脾胃除烦渴”,作为一种药食两用的药物,党参具有多种现代药理作用[17],可明显改善病人的心力衰竭症状[18-21];既往研究显示,党参能改善心力衰竭小鼠心肌细胞电生理重构[22];增加党参等益气药的比例,能更好地改善大鼠心室舒缩功能[23];单用或联合运用党参、黄芪可纠正细胞能量代谢重构,提高钙瞬变峰值,缩短回落时间,从而改善心功能[24-25]。在目前无切实有效的治疗药物的情况下,从中医角度探索治疗射血分数保留性心力衰竭的方法具有一定意义[26],本研究通过网络药理学方法探讨了党参在射血分数保留性心力衰竭治疗中的潜在机制。

本研究结果显示,通过TCMSP平台,设置OB和DL值筛选以及剔除无靶点成分,确定了16个党参有效成分,通过构建党参-有效成分-潜在靶点网络最终确定了党参治疗射血分数保留性心力衰竭的3个核心成分,分别是7-甲氧基-2-甲基异黄酮、木犀草素、11-羟基兰金断肠草碱。7-甲氧基-2-甲基异黄酮和木犀草素都属于黄酮类化合物[27],黄酮类化合物能抑制肿瘤、炎症,预防心血管疾病[28],增加一氧化氮(NO)的含量,减少活性氧(ROS)和促炎细胞因子的水平,从而发挥抗动脉粥样硬化的作用[29]。氧自由基对心脏重构具有重要作用,活性氧簇会加速心力衰竭的发展[30],木犀草素不仅能通过调控心肌细胞内过量氧自由基的生成,逆转线粒体DNA损伤,还可以通过调节MAPK途径减少脂多糖诱导的巨噬细胞损伤和氧化应激,从而延缓心力衰竭[31-32]。在改善心肌重构方面,其能恢复血管紧张素Ⅱ诱导的转化因子β1和结缔组织生长因子(CTGF)基因的表达,防治心肌纤维化和肥大[33],研究表示,心肌纤维化和细胞外胶原蛋白网络的变化与射血分数保留性心力衰竭的严重程度有关系[34]。肌浆/内质网钙ATP酶(SERCA2a)的表达在心脏舒缩过程中发挥重要作用[35],木犀草素能改变SERCA2a的表达、活性和稳定性,同时激活磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)通路,调节心肌细胞凋亡、代谢等,调节Ca2+循环,改善心肌细胞的收缩和舒张功能[36]。上述证据证明,黄酮类化合物可能是党参治疗射血分数保留性心力衰竭的有效成分。

对116个药物与疾病的共同靶点进行PPI网络分析获得5个党参治疗射血分数保留性心力衰竭的关键靶点,分别是:MAPK1、SRC、AKT1、MAPK3、EGFR。MAPK1、MAPK3是MAPK家族中的成员,是许多生物信号的结合点。目前认为MAPK通路主要由细胞外信号调节激酶(ERK)1/2、Jun氨基末端激酶(JNK)、p38、ERK5信号转导途径组成,通过激活3级酶促级联反应,可以引起各种细胞增殖、迁移、分化、自噬和炎症反应等,与慢性心力衰竭等多种心血管疾病的发生密切相关[37-38]。抑制MAPK3磷酸化,可以减少心肌纤维化、炎症反应,从而抑制心肌细胞中凋亡分子FasL诱导的扩张型心肌病和充血性心力衰竭的发展[39]。SRC是非受体酪氨酸激酶中的一种原癌基因,在多种细胞类型中广泛表达,SRC可在慢性压力负荷超载和急性机械牵张的情况下被激活[40-41],磷酸化的SRC与PI3K/AKT、MAPKs介导的炎症通路有关[42]。EGFR属于酪氨酸激酶受体家族,经过活化的EGFR可激活下游PI3K/AKT和MAPK促进细胞增殖[43]。基于通路分析,党参治疗射血分数保留性心力衰竭的通路主要与癌症(pathways in cancer)、环磷酸鸟苷/蛋白激酶信号通路(cGMP/PKG signaling pathway)、内分泌抵抗(endocrine resistance)、神经活性配体/受体相互作用(neuroactive ligand-receptor interaction)和血清素能突触(serotonergic synapse)有关。冠状动脉微血管内皮炎症引起NO的生物利用度和PKG的活性降低,致心肌细胞和间质纤维化,造成心肌肥大的发展,可能是射血分数保留性心力衰竭的机制之一[44]。cGMP/PKG信号通路可能通过调节不同的生物学功能参与射血分数保留性心力衰竭的发病机制,很多射血分数保留性心力衰竭病人存在心室病理性肥大,伴有间质纤维化和舒张期心室肌硬化,在培养的心肌细胞中可发现PKG刺激具有有效的抗纤维化作用,并且对压力超负荷肥大心脏起到明显的保护作用[45-46]。实验表明,党参组的红细胞、血红蛋白、血小板的数量明显升高,而NO参与了此机制,其可使血管扩张、cGMP含量增加,从而维持动脉基础张力[47]。结合GO分析结果,党参治疗射血分数保留性心力衰竭的作用可能是通过介导cGMP/PKG、MAPK、PI3K/AKT等信号通路抑制炎症、凋亡,调节代谢等多种生物学过程的整体调控发挥作用的。

综上所述,本研究结果表明党参可能通过作用于多个靶点,调节多条通路,抑制炎症反应,改善代谢,从而达到防治射血分数保留性心力衰竭的目的,采用分子对接的方法对关键靶点进行验证,党参的核心成分能与其最佳结合,其可靠性获得验证,为深入探讨党参治疗射血分数保留性心力衰竭的作用机制提供了科学的思路,并为下一步的临床和基础研究提供方向。