梨枣果皮中酚类物质高效液相色谱分析方法的确定

王 蕊

（山西运城农业职业技术学院，山西 运城 044000）

0 前言

梨枣含有丰富的营养物质和多种微量元素。在鲜枣果实中维生素C 的含量很高，每100 g 鲜果肉中含400～600 mg[1]，高于猕猴桃4～6倍，柑桔10倍，苹果80倍，梨100倍，同时还富含其它多种维生素。梨枣还含有较多的蛋白质以及铁、钙、磷等人体不可缺少的矿物质元素[2]。20 世纪80 年代，发现梨枣中含有丰富的环磷酸腺苷（cAMP）等物质[3-4]。总之鲜食枣风味独特，营养丰富，市场广阔，发展潜力巨大。

王如福[5]发现并首次提出枣在树上会正常着色，枣采后果皮也会转红，但是采后转红的枣与树上正常着色的枣相比颜色暗淡且无光泽。采后枣果皮的转红不是正常现象，可能是一种褐变。李红卫[5]研究发现枣果皮总酚含量与转红率显著相关，推测酚类物质的变化参与了果皮转色。本研究主要研究梨枣果皮7 种酚类物质的测定方法的确定，下一步进行梨枣果皮转红酚类物质的变化机理研究。

高效液相色谱测定法（high performance liquid chro-matorgraphy，简称HPLC）又称高压或高速液相色谱法，于1960 年开始应用。它是目前实验室应用最广泛、最有效的分离分析技术之一，具有分辨率高、分析速度快、重复性好、定量分析精确度高等优点，并可用作实验室小量色谱纯样品的制备。HPLC 是色谱法中的一个重要分支，据估计，自然界70%以上的化合物均可用高效液相色谱法分析[6]。

本试验将创建一种可同时测定7 种酚类物质的高效液相色谱测定法（HPLC），并对枣果果皮中的酚类物质进行分析测定。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以梨枣为试材，自树体东、南、西、北4 个方向，高度基本一致的果树上采摘均匀一致的果实，带回学院食品营养与检测实验室，用于枣的果皮中酚类物质高效液相色谱方法的分析确定。

1.2 测定方法

1.2.1 酚类物质的测定

使用Waters 高效液相色谱仪（含1525 二元泵、2487 双通道紫外检测器、Breeze 色谱管理软件等）对果皮酚类物质进行测定。

1.2.2 标准溶液的制备

将阿魏酸、原儿茶酸、儿茶素、表儿茶素、咖啡酸、绿原酸、没食子酸7 种标样分别准确称取0.01 g，用流动相溶解定容到100 mL 棕色容量瓶中当母液（100 mg/L）备用。将各种酚类物质的母液，配置成不同系列浓度的混合标准溶液，进行混合标准溶液的HPLC 混合测定，获得它们的标准曲线，从而建立起已知酚类物质浓度与HPLC 峰面积大小之间的函数关系。

1.2.3 枣果果皮中酚类物质的提取

准确称取3 g 果皮，研成匀浆，加入30 ml 乙酸乙酯超声提取30 min，过滤后残渣加入30 ml 乙酸乙酯，超声提取3 次。将提取液合并，旋转蒸发仪调节38 ℃蒸干。用甲醇溶解提取物定容至5 ml，置于冰箱-18 ℃保存。上机前用0.45 μm 过滤器过滤。

1.2.4 精密度试验

同一样品的各测定值的符合程度为精密度，用相对标准偏差（RSD值）表示。相对标准偏差的计算方法为

式中：

S——标准差；

X——n次重复测定结果的算术平均值；

Xi——n次测定中第i个测定值；

n——重复测定次数。

1.2.5 回收率试验

回收率试验用于评价所用测定方法的准确度。其计算方法为

式中：

P——加入的标准物质的回收率；

m——加入的标准物质的量；

X1——加标试样的测定值；

X0——未加标试样的测定值。

1.2.6 数据处理及分析

试验数据用Excel 软件进行整理，并进行分析。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的筛选

1）色谱柱的选择。常见的色谱柱有C18（ODS）和C8这2 种。由于C8填料的碳链长度比ODS短，相对极性较强，对极性相近的物质分离效果不理想。而梨枣果皮中的多酚物质的极性相近，分离时C18柱的柱效明显高于C8柱[7]。故本试验采用C18柱。由于要测定7 种酚类物质，使用长的色谱柱能提高分离度，本试验采用250 mm×4.6 mm，5 µm 的色谱柱可达到分离度的要求。

2）波长的选择。配备酚类物质标准品甲醇溶液，用紫外分光光度计在190～400 nm 波长范围内测定7 种酚类物质的紫外吸收情况。结果表明，7 种酚类物质在280 nm 均具有较强的吸收,故本试验HPLC测定波长选用280 nm。

3）流动相的选择。经查询资料得知，酚类物质的高效液相色谱分析一般采用一定比例的甲醇—水溶液、乙腈—水溶液或甲醇—乙酸—水溶液作流动相，进行梯度洗脱。通过试验表明，选用甲醇—乙酸—水溶液作流动相，酚类物质可以得到较好的分离。提高流动相的酸度，可以进一步改善分离效果[8]。

在乙酸浓度选择上，酸度为2%时，酚类物质的出峰时间提前，基线较平稳，但是各峰之间有挤压，离得较近；酸度为1%时，各峰分离度较好；酸度为0.6%时，由于酸度不够，基线不平，所以本试验采用甲醇—超纯水(1%乙酸)为流动相。

4）柱温的选择。柱温对分析时间影响较明显，柱温低，分析物质需要时间长；柱温高，可缩短分析时间。因此选择硅烷化键合相C18反相柱柱温为35 ℃。

5）流速的选择。流速的梯度变化对色谱分离的结果影响不是很大，而在流速1.00 mL/min时，分离效果最好，所以选择流速为1.00 mL/min。

6）洗脱方式的选择。本试验开始选择了等度洗脱，见图1，色谱条件为：65%甲醇，35%水（1%乙酸），柱温35 ℃，流速为1.00 mL/min，进样量为20 μL。

图1 3 种酚类物质混合标准溶液等度洗脱色谱图

配制的3 种酚类物质的混合标准溶液，经过HPLC 分析，分离效果非常不好，3 种酚类物质中只有2 个明显的峰值，出峰时间为2.632 min 和3.481 min。接着为了定性，分别对没食子酸，儿茶素，表儿茶素的单一标准溶液进行分析，见图2 至图4，这3 种单标出峰时间与混合标准溶液的出峰时间基本相同。

图2 没食子酸标准溶液等度洗脱色谱图

图3 儿茶素标准溶液等度洗脱色谱图

图4 表儿茶素标准溶液等度洗脱色谱图

由图5 可知，混标为峰值最高的，3 个与其重叠的是没食子酸、表儿茶素和儿茶素的色谱图。混标及单标色谱图汇总图表示，不管是混合标准溶液还是单个标准溶液，出峰时间均重叠，3 种酚类物质完全没有分离开，分离度太差，说明等度洗脱不能够使3 种酚类物质达到基线分离。所以本试验选择梯度洗脱来进行酚类物质的分离。

图5 混标及3 种单标汇总色谱图

经试验确定，5～40 min内，流动相甲醇由5%变化至30%，可使样品中各待测组分达到基线分离。最终选定梯度洗脱程序为：0 min 5 %A，40 min 30 %A，45 min 100 %A，55 min 100 %A，60 min 5 %A，标准溶液梯度为线性变化。流动相是色谱纯甲醇和1%的乙酸水溶液2 部分组成，甲醇溶液在40 min 内由5%上升到30%，对酚类物质进行分离，之后浓度升至100%，并维持10 min，把残留在色谱柱内的一些残留物洗净，结束后回到初始状态，进行平衡色谱柱，准备下一次进样分析。在这一色谱条件下，7 种酚类物质达到基线分离，见图6。

图6 混合标准溶液梯度洗脱色谱图

2.2 酚类物质保留时间

通过对色谱条件的筛选，最终确定了采用检测波长280 nm；柱温35 ℃；流速1.00 mL/min；流动相A 为甲醇，流动相B 为超纯水（1%乙酸）；并采用梯度洗脱程序：0 min 5 %A，40 min 30 %A，45 min 100 %A，55 min 100 %A，60 min 5 %A，为测定枣果果皮中酚类物质的最佳色谱条件，结果见表1。

表1 酚类物质的定性分析

2.3 酚类物质的定量分析（标准曲线法）

将酚类物质标准品配制成已知含量的标准溶液，在确定好的色谱条件下，将配制的标准溶液稀释成5 个浓度梯度,依次进样，以峰面积为纵坐标（Y），质量浓度为横坐标（X），得出7 种物质的线性回归方程、线性范围和相关系数详见表2。从表2 可以看出，7 种酚类物质标准品浓度与峰面积相关性较好，相关系数都达到0.99 以上。

表2 酚类物质在确定色谱条件下的标准曲线

2.4 样品测定

如图7 所示，将制备好的实际样品用上述选择的流动相、柱温、流速条件进行测定，没食子酸、原儿茶酸、儿茶素、绿原酸、咖啡酸、表儿茶素和阿魏酸在样品色谱图中的保留时间分别为5.216、9.004、15.287、18.286、20.103、24.632、33.961 min，与标准品色谱图保留时间5.178、9.138、15.306、18.151、20.072、24.695、34.061 min 基本一致。说明本试验分离纯化的样品和HPLC 色谱条件可以满足HPLC 对枣果果皮中酚类物质的分析测定。

2.5 样品回收率的测定

加标回收试验是分析方法中常用的，也是重要的质量控制手段，回收率是决定分析结果准确度的量化指标。本试验分别将100 μg 的7 种酚类物质标准品加入到样品中，按样品分析同样的步骤经HPLC定量计算样品回收率，并做5 次平行试验，测定结果如表3 所示。结果表明，7 种待测酚类物质的平均回收率分别为没食子酸：92.1%；原儿茶酸：95.8%；儿茶素：88.3%；绿原酸：92.8%；咖啡酸：94.5%；表儿茶素：91.4%；阿魏酸：92.6%。这说明本色谱分析方法的加标回收率符合定量分析要求，且相对标准偏差（RSD）低，因此上述的酚类物质提取和纯化方法以及高效液相色谱条件是可行的。

表3 酚类物质加标回收率试验结果（n=5）

3 讨论

在梨枣果皮酚类物质测定上，枣果皮酚类物质提取尤为重要，下面就枣果皮酚类物质提取方面进行讨论。

1）提取溶剂的选择上，乙酸乙酯萃取后,进行真空浓缩，得到的酚类物质纯度较高,产品的氧化程度较低[9]，故本试验选用乙酸乙酯来进行提取。

2）高温可以明显提高萃取效率。加热提升了细胞壁的通透性，加强了酚类物质的溶解度和扩散系数，降低了溶剂的粘度，有利于提取物透过性。但是，提取温度过高可能导致酚类物质降解，因此提取温度不超过35 ℃。在提取方式上，有震荡提取及超声波提取，由于超声波可以更快速有效地提取出酚类物质。本试验采用超声波提取。

3）增加提取次数，提取效率也会增高。比如用50 mL 甲醇溶剂提取6 次比用300 mL 提取1 次更有效。对试验材料进行连续3 次以上的提取才能得到较高的提取率，并且能增大试验材料与提取溶剂接触面。本试验采用乙酸乙酯超声波萃取3次，酯相合并旋转蒸发后，甲醇定容至5 mL 容量瓶，进行酚类物质的测定。

4）为保护色谱仪以及得到更准确的试验结果，流动相甲醇—乙酸溶液也要过0.45 μm 的滤膜，通过超声波处理除去流动相里的小气泡。标样及样品进样量20 μL，微量进样器内严格保证没有气泡。

从试验结果看，7 种酚类物质的回收率都在90%以上，而且结果稳定，这充分证明本方法是可靠的。但是，本方法能否应用于其它酚类物质的测定，还有待进一步研究。

4 结语

本试验以梨枣为材料，建立了高效液相色谱测定枣果果皮7 种酚类物质的色谱条件，色谱柱：大连依利特反相C18柱；紫外检测波长280 nm；柱温35 ℃；流速1 mL/min；进样量为20 μL；流动相A为甲醇，流动相B 为超纯水（1%乙酸）；梯度洗脱程序：0 min 5%A，40 min 30%A，45 min 100%A，55 min 100 %A，60 min 5%A。7 种酚类物质在40 min 内得到了很好的分离，且回收率均较高，RSD值也较低。

本文检测方法的创建对于检测梨枣果皮酚类物质在采后转红机制研究有着重要意义，酚类物质是否参与枣果采后褐变，这7 种酚类物质在采后枣果转红过程中的具体变化，均可使用本方法测定梨枣果皮酚类物质在树上正常着色及采后转红过程中变化对比。