贵州白山羊PRDM16基因变异及生物信息学分析
2023-05-08陈敏黄明捷刘霜云盘祖香刘江静游敏芳
陈敏 黄明捷 刘霜云 盘祖香 刘江静 游敏芳
(黔东南苗族侗族自治州畜牧技术推广站，贵州 凯里 556000)
贵州白山羊是我国著名的地方白山羊品种，主要分布于贵州的遵义、铜仁、黔东南等地区，具有适应性强、繁殖力强等特性，是贵州省重要的畜牧种质资源。近年来，因为自然和人为等因素导致贵州白山羊品种性能退化，个体生产性能差异过大，因此合理开发利用及保护贵州白山羊的种质资源迫在眉睫。
PRDM16基因(PR结构域蛋白16)又称MELI，而MELIS为MELI基因表达的另一蛋白产物，但MELIS缺少了PR结构域(PRD)，该结构对于PRDM16功能的发挥具有重要作用[1]。PRDM16基因存在高度同源性，该基因位于人类1号染色体上，是PR结构域家族中第16个成员。人类的PRDM16蛋白由1276个氨基酸组成[2]。PRDM家族中PRDM3与PRDM16在早期造血过程中起到重要作用[3]。研究发现，PRDM16基因变异与超重肥胖遗传机制具有一定关联性[4]。还有研究表明，PRDM16能调控小鼠脂肪肌肉的分化方向[5]。但山羊PRDM16基因相关的研究尚未见报道。综上，PRDM16基因可以作为贵州白山羊遗传育种改良的一个重要候选基因进行相关研究。本研究应用混合PCR测序方法检测PRDM16基因在贵州白山羊中的核苷酸变异结合生物信息学方法分析编码蛋白的分子特征，以期为后续利用PRDM16基因改良贵州白山羊种质资源提供重要的基础数据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
以贵州不同地区128只白山羊作为实验对象，颈静脉采采集血样约5.0mL保存，提取全基因组DNA，并将所得DNA稀释至相同浓度进行混合，用于后续PCR混合测序。
1.2 引物的设计与PCR扩增
根据NCBI中GeneBank山羊的PRDM16基因序列(登录号：NC_030823)，利用 Premier 5.0在线设计特异性引物扩增该基因9755-10366区域，用于检测核苷酸变异，引物见表1，由上海生物工程股份有限公司合成。PCR反应体系40μL，其中20μL的2×Master Mix，上下游混合引物各2μL，14μL的无菌双蒸水，2μL的DNA模板。PCR扩增条件：预变性温度为94℃(4min)；变性温度为94℃(30s)；退火温度为60℃(30s)；延伸温度为72℃(30s)；38个循环，72℃延伸10min。产物4℃保存。利用1.5%琼脂糖凝胶检测PCR产物，150V电泳15min。将检测无误的PCR产物送上海生工生物工程有限公司进行测序。
表1 PCR引物信息
1.3 数据处理
利用Lasergene的MegAlign程序分析贵州白山羊PRDM16的核苷酸变异；利用生物软件PopGene32计算得到PRDM16基因的基因型频率、等位基因频率、Hardy-Weinberg平衡P值，利用PIC计算软件得到其多态信息含量。
1.4 生物信息学分析
利用在线工具ExPASy的ProtParam tool(https：//web.expasy.org/protparam/)分析理化性质；利用ProtScale(https：//web.expasy.org/protscale/)预测亲水性及疏水性结构。利用TargetP(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)分析亚细胞定位；利用TMHMM(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分析跨膜区；利用SignaIP(http：//www. cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析信号肽区域；利用Net Phos 3.1(http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)分析磷酸化位点；利用PredictProtein(http：//www.predictprotein.org/)和SWISS-MODEL(https：//www.swissmodel.expasy.org/)分别预测分析二级结构和三级结构；在NCBI的GeneBank中分别下载保存牛、猪、鸡、犬等物种PRDM16的CDS序列，利用DNAStar软件分析其同源性并构建系统进化树；利用STRING(https：//string-db.org/)在线系统分析互作蛋白。
2 结果与分析
2.1 基因编码区扩增
将贵州白山羊PRDM16基因作为DNA模板，利用PCR扩增技术扩增目的片段，经琼脂糖凝胶电泳检测后发现目的条带与预期相同，约612bp，见图1a，可用于后续检测。混合PCR产物测序发现该序列存在g.342 G/A核苷酸突变，见图1b。
图1 贵州白山羊PRDM16基因PCR产物及测序结果
2.2 贵州白山羊PRDM16基因多态性分析
贵州白山羊PRDM16基因中共有2种等位基因(A和G)，其频率分别为36.97%、63.03%；有3种基因型，即AA、AG、GG，其频率分别约为13.67%、46.60%、39.73%，如表2所示。由多态信息含量以及表2可知，本实验贵州白山羊PRDM16基因在群体中属于低度多态(0.5>PIC>0.25)，该基因在群体遗传中并处于Hardy-Weinberg平衡状态(P=0.03)。
表2 贵州白山羊PRDM16基因遗传特征
2.3 PRDM16基因蛋白质理化性质分析
利用在线工具ProtParam分析PRDM16蛋白的理化性质，各氨基酸的组成如表3所示。PRDM16的CDS区长3814bp，共编码1271个氨基酸，分子式为C6133H9545N1717O1904S57，原子总数为19356个，相对分子质量为139624.04kU，带负电荷的残基总数为172个，带正电荷的残基总数为143个，亲水性平均值(GRAVY)为-0.671，脂肪族指数为62.77，估计半衰期为30h，不稳定指数为58.72，理论等电点(PI)为5.93，说明为酸性不稳定蛋白。
表3 PRDM16蛋白编码氨基酸组成
2.4 亲/疏水性的分析
利用在线系统ProtScale分析贵州白山羊PRDM16蛋白的亲/疏水性，所得结果如图2，其表明第556号的氨基酸亲/疏水性最大(1.867，正值)，第632和634号的氨基酸亲/疏水性最小(-3.133，负值)。与前面理化性质分析的结果相符合，总体表现为亲水性。
2.5 亚细胞定位、跨膜区及信号肽分析
利用在线工具TargetP分析PRDM16蛋白亚细胞定位情况，结果表明该蛋白位于胞外；利用TMHMM分析PRDM16蛋白的跨膜结构，见图3a，该蛋白没有跨膜区，表明其不是跨膜蛋白或者无法于细胞膜上定位；利用SignaIP分析该蛋白的信号肽区域，结果如图3b所示，不存在信号肽区域。
图3 贵州白山羊PRDM16跨膜区与信号肽区域分析
2.6 PRDM16蛋白结构域与磷酸化位点预测
利用在线系统Prosite预测PRDM16蛋白的结构域，见图4a，结果表示有9段氨基酸序列吻合ZINC蛋白的结构域，分别是278～305、306～333、334～362、363～390、391～418、420～447、947～974、975～1003、1004～1031；利用在线软件Net Phos 3.1分析该蛋白的磷酸化位点，结果如图4b所示，其存在141个磷酸位点，其中酪氨酸19个，苏氨酸39个丝氨酸83个。
2.7 PRDM16蛋白的二级、三级结构预测分析
分别利用PredictProtein和SWISS-MODEL预测贵州白山羊PRDM16蛋白的二级、三级结构，见图5，结果表明，其二级结构中α螺旋(Alpha helix)占27.22%，β折叠(Beta turn)占5.11%，伸展链(Extended strand)占7.16%，无规则卷曲(Random coil)占60.50%。三级结构预测结果说明其三级结构以无规则卷曲为主，见图6。
图5 贵州白山羊PRDM16二级结构预测示意图
图6 贵州白山羊PRDM16三级结构预测示意图
2.8 同源性分析及系统进化树构建
在NCBI的GeneBank中分别检索到山羊(NC_030823)、牛(NC_037343.1)、狗(NC_006587.4)、猪(NC_010448.4)、鸡(NC_052552.1)、马(NC_009145.3)、鸭(NC_048913.1)、鳟鱼(NC_048573.1)、沟鼠(NC_051340.1)和龟(NC_024234.1)的PRDM16基因编码的序列，接着利用软件DNAstar 7.0进行同源性分析，见图7a，且构建得到一个系统进化树，见图7b。同源性比较结果表明，山羊与牛的同源性最高(97.1%)，而与鳟鱼同源性最低(75.5%)，亲缘关系相离最远，与其他物种的同源性如图所示依次为狗(88.9%)、猪(90.7%)、鸡(79.0%)、马(90.6%)、鸭(76.8%)、沟鼠(85.3%)、龟(78.2%)。其结果与系统进化树结果一致，该基因在物种之间相对保守和符合物种进化的原则。
注：图a中1为山羊，2为牛，3为狗，4为猪，5为鸡，6为鳟鱼，7为马，8为鸭，9为沟鼠，10为龟；左下为核苷酸序列散度(分歧)结果，右上为核苷酸序列同源性结果。图7 贵州白山羊PRDM16核苷酸序列同源性比较及进化树分析
2.9 互作蛋白预测
利用在线系统STRING检索10个可能与山羊PRDM16蛋白的互作蛋白，结果表明，筛选出的10个相互蛋白中，与其作用性最好的是KDM1A、ZNF516和PPARG蛋白，见图8。
图8 PRDM16蛋白的互作蛋白预测
3 讨论
有研究发现，PRDM16在棕色脂肪组织细胞发育过程中起着正向调控作用，促进棕色脂肪组织细胞中一些活性蛋白，如PPARγ、adiponectin、Cidea、UCP1等的特异性基因表达，使得白色脂肪组织细胞中一些活性蛋白，如psatl、serpin3ak和resistin等的特异性基因的表达被抑制，在白色脂肪中能使棕色脂肪相关特异性基因的表达被激活[6]。有研究表明，PRDM16基因主要在棕色脂肪细胞大量表达，可以增强该类细胞功能[7]。棕色脂肪细胞经增强氧化作用以热量的形式散失，从而具有潜在对抗肥胖的作用[8]。PRDM16基因则可能影响棕色脂肪细胞分化[9]。因此，PRDM16基因可作为调控动物机体生长性状的一个重要候选基因进行研究。
贵州白山羊是有利于发展贵州畜牧业的重要种质资源之一。而研究表明，PRDM16在畜禽动物的生产性能方面存在一定的影响，在不同内分泌及营养条件下存在着一定的调控作用，存在能量代谢和肌肉脂肪分化方向的生物学作用，并且调控骨骼肌以及脂肪的形成[10]，推测这可能与本研究所得该基因所编码蛋白的氨基酸组成有一定联系。目前在畜禽上关于PRDM16基因的研究还相对较少，仅发现PRDM16基因多态性与不同品种牛、山羊等的生产性能存在一定相关性，并且这可能与本研究中牛和山羊同源性较高的结果有关。PRDM16、CIDE-B蛋白表达和成人肥胖存在一定的联系，体重正常者的PRDM16蛋白表达量较超重肥胖者的高(皮下脂肪组织中)[11]，本研究也发现PRDM16、CIDE蛋白存在互相作用有一定相关性。综上所述PRDM16基因可作为改良贵州白山羊生长性状的一个重要候选基因进行深入挖掘。
4 结论
贵州白山羊PRDM16基因序列在g.342处存在G/A突变，该基因CDS区长3814bp，共编码1271个氨基酸，为酸性不稳定蛋白，表现为亲水性；无跨膜结构和信号肽区域；共有有141个磷酸位点，二级、三级结构以无规则卷曲为主；同源关系表明山羊与牛亲缘关系最近，与鳟鱼最远；其与KDM1A、ZNF516和PPARG蛋白等作用性是最好的。本研究为进一步分析贵州白山羊PRDM16基因对山羊的经济性状影响研究提供一定的理论依据。
