响应面法优化妇科消糜栓的提取工艺

阿吉然姆·阿布拉,古丽米拉·卡德尔,吴 静,阿布来提·阿布力孜*

1.阿克苏地区维吾尔医医院,阿克苏 843000;2.新疆医科大学药学院,乌鲁木齐 830011

我国对植物药的应用已有几千年历史,我国中草药的使用从原始的煎煮到膏方、丸丹散剂、颗粒剂、片剂、栓剂、胶囊剂及注射剂等,新剂型不仅提高了药物的使用范围,并在一定程度上提高了药物的疗效[1]。消糜栓的处方组成包括黄连、菝葜、石榴皮、野苜蓿、洋甘菊、赤石脂、洋乳香、乳香、西黄耆胶。其中君药黄连是毛茛科多年生草本植物,最早载于《神农本草经》,并被列为上品,据《外科正宗》记载,黄连清热燥湿、泻火解毒,连翘清热解毒、消肿散结。黄连含小檗碱(7%～9%)[2]、黄连碱、甲基黄连碱、掌叶防己碱、药根碱等生物碱以及阿魏酸等酚性化合物和多种微量元素,具有抗微生物及抗原虫、抗病毒、抗溃疡、抗炎[3]、抑制血小板聚集和释放等作用[4-5],对急、慢性炎症反应均有明显对抗作用,且具有广谱的抗菌活性。黄连与诸药相比,有其独特之处,它既能以苦燥湿,又能以寒除热,一举两得。因此对黄连的开发利用,如研制新药方面,具有广阔的国际市场前景。石榴皮所含的化学成分多,对人体有预防和保健作用,其提取物具有明显抗菌活性,甲硝唑耐药株及敏感株均对其敏感[6-7]。菝葜则能消肿解毒、祛风利湿,有抗炎镇痛及抗肿瘤作用[8-9]。野苜宿中的苜宿素主要通过抑制炎症介质释放,发挥抗炎作用[10-11]。《本草纲目》中记载乳香的药理作用有抗炎、抗肿瘤、抗纤维化、抗哮喘,在临床上主要用于治疗风湿、类风湿性关节炎及骨关节炎,且炮制后的乳香抗炎活性更为显著[12-13]。其他入药成分洋甘菊、赤石脂、洋乳香也具有抗菌、抗炎活性[14-16]。

消糜栓的抑菌、杀菌作用强,能提高细胞吞噬致病菌能力,对假丝酵母菌、滴虫及革兰氏阴性菌、大肠杆菌、绿脓杆菌有极强的抑制活性和杀灭作用[17-18],并具有抑制炎性介质分泌、凝固相关蛋白,发挥收敛作用、促进创面愈合、减少白带增多等功效。消糜栓可通过保护生理菌群的生长,迅速减轻外阴瘙痒,其含有的营养物质可为黏膜细胞提供营养,改善微循环,促进黏膜鳞状细胞的再生,加速创面愈合,增强免疫能力,使病变部位加速恢复到正常的生理功能。

1 仪器与试药

1.1 仪器

AUW120型分析天平(上海梅特勒托利多有限公司); 2489紫外可见光检测器-e2695高效液相色谱仪(美国Waters有限公司);KDM型电热套(山东鄄城华鲁电热仪器有限公司);HHS-6S型电子恒温不锈钢水浴锅(上海光地仪器设备有限公司);TFCW-12B型超微粉碎机(天方机械有限公司);Cascada PT型超纯水制备系统(美国PALL公司)。

1.2 试药

没食子酸对照品(批号YA0505YA14,上海源叶生物科技有限公司);甲醇、乙腈为色谱纯;乙酸乙酯、甲苯、石油醚(沸程为60 ℃～90 ℃,30 ℃～60 ℃)均为分析纯;水为实验室自制超纯水。

黄连、菝葜、石榴皮、野苜蓿、洋甘菊、赤石脂、洋乳香、乳香、西黄耆胶均由新疆阿克苏地区维吾尔医医院提供,经阿克苏地区维吾尔医医院药剂科主任吴静副主任中药师鉴定为正品药材。

2 实验方法

2.1 处方介绍

消糜栓的处方组成:黄连15 g,菝葜15 g,石榴皮15 g,野苜蓿15 g,洋甘菊15 g,赤石脂10 g,洋乳香10 g,乳香10 g,西黄耆胶5 g。黄连、菝葜、石榴皮、野苜蓿、洋甘菊用蒸馏水提取后与赤石脂、洋乳香、乳香、西黄耆胶配成处方药制备成栓剂。

2.2 对照品溶液的配制与标准曲线的绘制

2.2.1没食子酸对照品溶液的配制与标准曲线的绘制 精密称取10 mg没食子酸对照品溶解后,放入10 mL量瓶中定容,再精密量取0.75、1.5、2.25、3、3.75 mL分别定容到10 mL量瓶中,得到没食子酸溶液75、150、225、3、3.75 μg·mL-1。 色谱条件:色谱柱(C18,50 mm×4.6 mm,5 μm),流动相为甲醇(A)-纯化水溶液(B),A∶B=8∶2,等度洗脱。2 μL进样,以质量浓度为横坐标(x)、峰面积为纵坐标(y),绘制标准曲线,y1=8 641.7x1-22 596(r=0.999 6),线性范围为75～375 μg·mL-1。

2.2.2盐酸小檗碱对照品溶液的配制与标准曲线的绘制 精密称取10 mg盐酸小檗碱对照品,溶解后定容至100 mL量瓶中,再精密量取0.5、1、1.5、2、2.5 mL分别定容至10 mL量瓶中,得到没食子酸溶液50、100、150、200、250 μg·mL-1。色谱柱条件:色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流动相为乙腈(A)-体积分数为2 mL·L-1的磷酸水溶液(B),梯度洗脱。2 μL进样,以质量浓度为横坐标(x)、峰面积为纵坐标(y),绘制标准曲线,y2=90.028x2-0.080 7(r=0.999 9),线性范围为50～250 μg·mL-1。

2.3 方法学考察

2.3.1精密度实验 精密称取样品浸膏配成10 mg·mL-1的供试品溶液,在上述色谱条件下测定没食子酸和盐酸小檗碱含量,重复实验6次,计算相对标准偏差(relative standard deviation, RSD)值。

2.3.2加样回收率实验 精密称取样品浸膏配成10 mg·mL-1的供试品溶液18份,每组3份,按低、中、高(16、20、24 μg·mL-1)3个水平分别加入等量的没食子对照品,24、30、36 μg·mL-13个水平分别加入等量的没食子对照品,在上述色谱条件下测定没食子酸含量、盐酸小檗碱含量,计算RSD。

2.4 消糜栓中没食子酸、盐酸小檗碱的提取

2.4.1单因素实验 本研究主要考察选择粉碎程度、料液比、浸泡时间和提取时间4个因素对消糜栓中没食子酸、盐酸小檗碱和浸膏得率的综合影响。分析粉碎程度(最粗粉、粗粉、中粉、细粉),料液比(1∶10、1∶14、1∶18、1∶22 g·mL-1),浸泡时间(3、6、12、24 h),提取时间(0.5、1、2、3 h),确定其适宜的提取范围,以浸膏得率、没食子酸含量和盐酸小檗碱进行考察这4个因素,考虑药物在后期的生产效率以及保证药物的有效性,以综合评分为参考指标,更能客观地分析实验结果,新制定综合评分项,即综合评分(%)=浸膏得率×0.5+没食子酸含量×0.15+盐酸小檗碱×0.35。

2.4.2响应面实验 以单因素实验数据为基础,选择粉碎程度(A)、料液比(B)、浸泡时间(C)、提取时间(D)为因素,以综合评分为响应值,用Design-Expert 8.06软件建立4因素3水平响应面实验,优化妇科消糜栓的最佳提取工艺,实验因素与水平见表1。

表1 响应面实验设计因素与水平

2.5 数据分析

用Graph prism 8.0.4对所得数据进行处理,用Design-Expert 8.0.6.1进行响应面分析,每组实验重复3次并取平均值。

3 结果与分析

3.1 妇科消糜栓含量测定及方法学验证

方法学验证结果显示,精密度实验RSD值为1.3%<2%(n=6),表明精密度良好;加样回收率实验的低、中、高各个水平的回收率的RSDs值分别为0.72%、0.83%、0.95%(没食子酸对照品组),0.92%、0.86%、1.58%,均小于2%。表明该方法具有良好的准确度。见图1。

图1 没食子酸含量测定的色谱图

3.2 单因素实验结果

3.2.1粉碎程度对妇科消糜栓提取的影响 见图2A。从图2A可知,随着粉碎程度的增加,综合评分呈先增加后减小趋势。中粉时,浸膏得率、盐酸小檗碱、没食子酸含量达到最高,综合评分最高,而且中粉与粗粉之间的差异极显著,中粉与细粉之间的差异显著。粉碎程度会影响有效成分的浸出,但是细粉之间分子间距较小,流动速度慢,会降低溶剂渗入,导致提取效率及综合评分降低等。因此,消糜栓药材的最佳粉碎程度为中粉。

3.2.2提取时间对妇科消糜栓提取的影响 见图2B。从图2B可知,随着消糜栓提取时间的增加,综合评分呈先增加后减小趋势。提取时间为2 h时,浸膏得率、盐酸小檗碱、没食子酸含量达到最高,综合评分最高。而且提取2 h与1 h、2 h与3 h之间的差异极显著。提取时间为3 h时,综合评分降低,这可能是因为提取时间增加会增加杂质成分,影响质量分数,会间接影响有效成分。可见,最佳提取时间为2 h。

3.2.3料液比对妇科消糜栓提取的影响 见图2C。从图2C可知,随着料液比的增加,综合评分呈先增加后减小趋势。料液比为1∶18 g·mL-1时,浸膏得率、盐酸小檗碱、没食子酸含量达到最高,综合评分最高。而且料液比1∶18 g·mL-1与1∶14 g·mL-1、1∶18 g·mL-1与1∶22 g·mL-1之间的差异极显著。这可能是因为刚开始随着溶剂量增加,有效成分不断渗出,此时再增加料液比,可能会影响其他杂质的含量,可能这些杂质会降低有效成分含量。

3.2.4浸泡时间对妇科消糜栓提取的影响 见图2D。从图2D可知,随着浸泡时间的延长,综合评分呈先增加后减小趋势。浸泡时间为12 h时,浸膏得率、盐酸小檗碱、没食子酸含量达到最高,综合评分最高。而且提取12 h与6 h、12 h与24 h之间的差异极显著。浸泡时间为12 h时,综合评分降低,这可能是因为浸泡时间延长会增加杂质成分、色素的浸出,影响质量分数,间接影响有效成分。可见最佳浸泡时间为2 h。

图2 粉碎程度、提取时间、料液比、浸泡时间对妇科消糜栓综合评分(盐酸小檗碱、没食子酸含量、浸膏得率)的影响(n=3)

3.3 响应面优化结果与分析

3.3.1响应面优化实验结果 根据单因素实验结果,以粉碎程度、料液比(g·mL-1)、浸泡时间(h)、提取时间(h)为实验因素,没食子酸含量、浸膏得率、盐酸小檗碱含量、综合评分为响应值,设计4因素3水平对妇科消糜栓的提取工艺进行优化,其设计与结果显示如表2所示。在此基础上对回归模型进行方差分析,结果见表3。

表2 响应面法分析实验结果

3.3.2模型的建立与统计分析 通过Design-Expert8.0.6软件对上述表2中的数据进行多元回归拟合,得到妇科栓剂消糜栓,得到了以综合评分(Y)为响应值对编码自变量A粉碎程度、B料液比(g·mL-1)、C浸泡时间(h)、D提取时间(h)的四元二次回归分析。得到了综合评分(Y)为响应值的回归方程:Y=-2 985.26-5.11A-605.09B-1 927.65C-61.77D-0.89AB+0.27AC-1.19AD-5.59BC-3.37BD-15.31CD-4.37A2-66.01B2-563.9C2-5.4D2。

表3 方差分析结果

图3 浸泡时间与提取时间交互作用对妇科消糜栓综合评分影响的响应面及等高线图(n=3)

3.3.4验证实验 根据响应面回归模型预测妇科消糜栓提取的最佳条件为:粉碎程度为中粉,料液比为1∶19 g·mL-1,浸泡时间为12 h,提取时间为2 h,此时妇科消糜栓按照上述计算公式得最终理论预测值为26.023 7。并在此最优配方下进行3次平行实验验证,可得妇科消糜栓的综合评分为25.98,与预测值接近,证明模型可行。

4 结论与讨论

妇科消糜栓中主要活性成分为没食子酸(GA)、盐酸小檗碱,GA还具有抗菌、抗病毒、抗炎等作用, 也可通过灭活游离病毒粒子、阻碍病毒与宿主细胞结合,阻止丙型肝炎病毒(HCV) 早期的细胞侵入和感染,还通过上调p53蛋白,诱导含人瘤病毒(HPV)基因序列细胞凋亡,抑制人类宫颈上皮细胞(HPVep)的繁殖。小檗碱对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌等均具有一定的抑菌作用,在体外能够抑制金黄色葡萄球菌的生长。因此,提高上述成分的提取率是优化提取工艺的关键。

本研究将妇科消糜栓的提取工艺优化,改进传统工艺,用单因素和响应面法分析了粉碎程度、料液比、提取时间、浸泡时间对盐酸小檗碱含量、没食子酸含量、浸膏得率的影响,并得到了最佳提取条件,粉碎程度为中粉、料液比1∶19 g·mL-1、提取时间为2 h、浸泡时间为12 h。为今后消糜栓成型工艺、具体作用机制研究奠定基础。