甘薯离体诱变与抗盐突变体鉴定

韩婷婷 吕运韬 石源睿 刘世芳 唐锐敏 张红梅 贾小云

（山西农业大学生命科学学院，山西 太谷 030801）

甘薯［Ipomoea batatas（L.）Lam］是我国重要的粮食作物之一，富含糖类、蛋白质、膳食纤维、维生素C和D 等多种成分，有较高的营养价值［1］。甘薯耐旱耐瘠薄，在保障国家粮食安全方面具有重要作用［2］。盐胁迫是影响作物产量的非生物胁迫之一，目前全世界约有9.6 亿公顷盐碱地，大约有20%的耕地受到土壤盐渍化危害［3-4］。土壤中盐分过多，使作物不能正常生长，进而导致产量降低，严重制约了农业发展［5-6］。因此，甘薯抗盐新品种的创制与培育，对于利用盐碱地土壤进行作物生产具有重要意义。

化学诱变剂主要可分为三种：第一种为碱基类似物诱变剂，主要通过取代核酸中碱基使DNA 复制发生错配，如5-溴尿嘧啶；第二种为烷化剂，通过烷基化DNA 分子上的碱基及磷酸，导致碱基错配引起突变，如甲基磺酸乙酯；第三种为移码诱变剂，与DNA 相互结合通过引起碱基缺失或增加导致突变，如吖啶类［7］。平阳霉素（Ping yang mycin，PYM）属于新型诱变剂，是轮枝链霉菌平阳变种产生的一种糖肽类抗生素，可引起以染色体断裂为主的高频率的染色体畸变，从而使细胞发生变异［8］。与其他诱变剂相比，PYM 具有诱变频率高、诱变范围大、安全性高、对人体毒性小等优点［9］。

目前已有很多有关PYM 离体诱变筛选作物优质突变体的研究。Sui 等［10］和Zhao 等［11］以PYM 为诱变剂，分别获得了耐旱、抗盐花生突变体。刘文林等［12］通过将PYM 注入小麦叶鞘和颖壳，获得的突变株的小穗数显著高于对照。Gao 等［13］以甲基磺酸乙酯（ethyl methyl sulfonate，EMS）与PYM 为诱变剂，体外诱变大麦小孢子，获得了氮吸收利用效率提高的大麦突变体。张丹丹等［14］以烟薯25 的茎尖为外植体，利用PYM 诱变获得了单株鲜薯重量显著高于诱变亲本的突变体。张希太［15-16］以PYM 诱变不同小麦品种，获得了株高、芒型、穗型等表型发生变异的突变体，并在这些变异种质的基因组中发现了大量的变异位点。黄丽华等［17］发现PYM 对烟草出苗率、苗高、主根长、根数、叶绿素含量等指标有较强的诱变效应。然而目前PYM 在甘薯化学诱变中的相关研究较少，因此，本研究以徐薯18为诱变亲本，结合PYM 化学诱变和组织培养技术定向筛选性状优良的抗盐突变体，以期为选育抗盐性强的甘薯新品种提供育种材料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试的甘薯栽培品种徐薯18（XS-18）由国家种质徐州甘薯试管苗库提供，山西农业大学薯类作物研究室种植并保存。

1.2 试验方法

1.2.1 培养基及培养条件 试验所用培养基均以MS 为基本培养基，添加3%蔗糖和0.3%琼脂，pH 值5.9。诱变培养基为添加PYM 的MS 培养基，培养条件均为25～27 ℃，光照时间13 h，光照强度为70～90 µmol·m-2·s-1。

1.2.2 徐薯18 茎段组织的PYM 诱变 以不含PYM的MS 培养基为对照，分别在MS 培养基中添加低浓度的PYM（0.25、0.50、0.75 mg·L-1）与高浓度的PYM（1.00、3.00、5.00 mg·L-1）。徐薯18 组培苗切成1 cm保留1个叶芽的茎段后扦插于含有不同浓度PYM的诱变培养基中，每组接种50 个茎段，重复3 次，诱变处理14 d后统计存活数，并计算存活率与致死率，确定50%致死率的PYM 诱变浓度。将1.00 mg·L-1PYM 处理后的株系用于抗盐突变体筛选，然后在1.00 mg·L-1PYM半致死浓度下继续诱变徐薯18，扩大诱变株系至4 855株，并用于抗盐突变体的筛选。

1.2.3 NaCl 筛选临界浓度的确定及甘薯抗盐植株筛选 将未经诱变处理的徐薯18 茎段接种至含不同浓度 NaCl（0、25、50、75、100、125 mmol·L-1）的MS 培养基中，培养21 d 后根据植株的生长情况和生根率确定NaCl 的筛选浓度。然后将经过PYM 诱变处理的甘薯突变体茎段接种到含125 mmol·L-1NaCl 的筛选培养基中，培养21 d后观察突变体表型，根据生根率初步筛选抗盐植株。

1.2.4 甘薯抗盐突变体生理指标的测定 对初步筛选得到的生根率排前三的3株PYM诱变株系进行形态指标的测定，包括根长、株高、根重、地上部鲜重和总鲜重；盐胁迫相关生理指标的测定，包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化物酶（peroxidase，POD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）活性及丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量。SOD 测定试剂盒、POD测试盒、CAT 测定试剂盒、MDA 测试盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.2.5 甘薯抗盐突变体中盐胁迫相关基因的表达分析 将甘薯抗盐突变植株与对照徐薯18 在含180 mmol·L-1NaCl 的霍格兰营养液中培养12 h 后，提取总RNA，反转录成cDNA。利用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）分析盐胁迫相关基因的表达情况，包括超氧化物歧化酶基因（IbSOD）、过氧化物酶基因（IbPOD）、抗坏血酸过氧化物酶基因（IbAPX）和Na+/H+逆向转运蛋白基因（IbSOS）。利用Primer-BLAST（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）设计甘薯盐胁迫相关基因的定量引物。以IbActin作为内参基因，采用2-ΔΔCt法分析试验数据。引物（3＇→5＇）分别为IbActin-F：AGCAG CATGAAGATTAAGGTTGTAGCAC/IbActin-R：TGGAAA ATTAGAAGCACTTCCTGTGAAC；IbSOD-F：TCCTGGA CCTCATGGATTTC/IbSOD-R：GCCACTATGTTTCCCAG GTC；IbPOD-F：ACAGCAAGACGGGTGGCTTA/IbPOD-R：GTAGGCGGGAGTTCCTGGTT；IbAPX-F：CCTGCTGGTC ATTTACGTGA/IbAPX-R：CTGGCCCATCTTTGGTGTAT；IbSOS-F：TGATGAACGATGGGACGGCAA/IbSOS-R：AT GCCACTCCAAAGGCAAGAC。植物RNA提取试剂盒购自北京华越洋生物公司，Prime ScriptTMRT reagent Kit和SYBR ScriptTMRT reagent Kit Ⅱ购自日本TaKaRa公司。

1.2.6 数据处理 每个试验设置3 次重复，用Excel 2016和SPSS 20.0进行数据统计和分析。

2 结果与分析

2.1 PYM诱变处理徐薯18茎段半致死浓度的确定

用不同浓度PYM 处理14 d 后甘薯茎段的生长状况如图1。随着PYM 诱变浓度的升高，PYM 对茎段生长的抑制作用增加。当PYM 诱变浓度为0.25～1.00 mg·L-1时，PYM 对茎段生长的抑制作用较弱，甘薯茎段均可生根并长出新的叶芽（图1-A）；当PYM 浓度超过1.00 mg·L-1时，甘薯茎段的生长受到强烈的抑制作用，茎段不生根且褐化现象加剧（图1-B）。当PYM 浓度为1.00 mg·L-1时，徐薯18 茎段存活率为56%，当PYM 浓度为5.00 mg·L-1浓度时，茎段全部死亡。因此，确定1.00 mg·L-1PYM为甘薯茎段诱变14 d的半致死浓度。

2.2 抗盐突变体NaCl筛选临界浓度的确定

由图2可见，不同浓度的NaCl处理均抑制了徐薯18的生长，且随着NaCl浓度的升高，抑制作用增强，生根率降低。当NaCl浓度为125 mmol·L-1时，地上部和地下部生长均受到严重抑制，生根率低于20%。因此，125 mmol·L-1NaCl为筛选徐薯18抗盐突变体的临界浓度。

图2 不同浓度 NaCl 处理下徐薯 18 的生长情况Fig.2 The growth state of Xushu 18 under different NaCl concentration

2.3 甘薯抗盐诱变材料的筛选

在1 mg·L-1PYM（半致死浓度）下诱变徐薯18，共获得4 855 株诱变株系，将获得的诱变株系接种到含125 mmol·L-1NaCl的MS培养基中培养28 d，以生根率作为抗盐筛选指标筛选抗盐突变体。对盐胁迫下的不同诱变株系的生根率进行统计，发现有43 株生根。生根率最高的3株突变体分别为75-2、52-1、33-1，生根率分别为100%、95%、95%，均高于徐薯18。植株生长状况如图3所示，正常生长条件下（0 mmol·L-1NaCl +MS 培养基），3 株突变体的根长、根鲜重与对照徐薯18 无明显差异（图3-A）；盐胁迫下（125 mmol·L-1NaCl +MS 培养基），对照徐薯18 的生长受到明显抑制（图3-B），且在该处理下的突变体33-1、52-1、75-2 株高、根长、根鲜重、地下部鲜重、总鲜重均显著高于对照徐薯18，3 株突变体盐胁迫下的形态指标变化量均低于徐薯18，表明3株突变体耐盐性高于徐薯18（表1）。

表1 正常生长和125 mmol·L-1 NaCl胁迫下徐薯18及其突变体的形态指标Table 1 Morphological index of the Xushu 18 and mutants under normal growth and 125 mmol·L-1 NaCl stress

图3 正常处理和盐胁迫下徐薯18及其突变体的生长状况Fig.3 The growth of Xushu 18 and mutants under normal treatment and NaCl stress

2.4 盐胁迫对徐薯18突变体抗氧化酶活性的影响

SOD、POD、CAT 活性是评价植物抗逆性强弱的重要生理指标［18］。由图4 可知，正常生长情况下，徐薯18 的保护酶活性与3 株突变体植株之间无显著差异。在盐胁迫下，突变体33-1、52-1、75-2的SOD、POD、CAT活性均升高，且显著高于对照徐薯18（图4-A～C）。3 株突变体中75-2 突变株的SOD 和CAT 活性最高，52-1突变株的POD 活性最高。MDA 是膜脂过氧化作用的产物，MDA过量积累会改变细胞膜的通透性，是膜系统受损害的重要标志之一［19］。盐胁迫下，3株突变株系的MDA 含量均显著低于徐薯18，其中75-2 突变体的MDA 含量最低（图4-D），表明突变体植株的细胞膜系统受损伤较低或者细胞清除MDA能力较高。

图4 盐胁迫对徐薯 18 及其突变体抗氧化酶活性的影响Fig.4 Effect of salt stress on antioxidant enzymes of the Xushu 18 and mutants

2.5 甘薯突变体抗盐性隶属函数分析

为了全面评价PYM 诱变后徐薯18 突变株的抗盐性，采用Fuzzy 数学中的隶属函数，对盐胁迫下各个性状指标进行综合评价来评定抗盐性。隶属函数值即其加权值，加权值越大，表示抗盐性越好［20］。若生理指标与抗盐性成正相关，隶属函数X=（Xi-Xmin）/（Xmax-Xmin）；若生理指标与抗盐性成负相关，隶属函数X=1-（Xi-Xmin）/（Xmax-Xmin）。Xi代表生理指标测定值；Xmin代表对应生理指标的最小值；Xmax代表对应生理指标的最大值。由表2 可知，52-1、75-2、33-1 突变体加权值均大于徐薯18，表明这3 株突变株的抗盐性高于徐薯18。

表2 盐胁迫下徐薯18及突变体各指标的隶属函数值Table 2 The membership function of Xushu 18 and mutants under NaCl stress

2.6 盐胁迫下甘薯突变体抗性相关基因的表达分析

采用qRT-PCR 分析0和180 mmol·L-1NaCl胁迫下的徐薯18 和突变体盐胁迫相关基因的表达水平，结果如图5所示。盐胁迫处理12 h 后，徐薯18 及突变体（75-2、52-1、33-1）中盐胁迫相关基因IbSOD、IbPOD、IbAPX、IbSOS的表达量均提高，且均显著高于对照徐薯18。其中，75-2 突变体中的IbSOD基因表达量最高，52-1突变株IbPOD与IbAPX基因表达量最高，33-1突变体中的IbSOS基因表达量最高。

图5 盐胁迫下徐薯18及其突变体抗性相关基因的表达Fig.5 Expression of salt-resistant genes in Xushu 18 and mutants

3 讨论

甘薯是种植广泛的块根作物之一，而盐胁迫往往会降低其产量，因此，培育抗盐性高的甘薯新品种具有重要意义。化学诱变育种是作物遗传改良、提高育种效率和新品种创新的重要途径，而且通过化学诱变获得的特异性突变体有利于阐明基因的功能与作用机理［21-22］。离体诱变已在多种植物，如东云、鸢尾、木薯等种质资源的改良中取得成功［23-25］。PYM 作为一种安全、高效、诱变频率高的化学诱变剂，已在多种作物中得到应用［8］。本研究以PYM 诱变徐薯18茎段，确定PYM 诱变徐薯18 茎段的半致死浓度为1.00 mg·L-1，为甘薯的化学离体诱变提供了参考依据。

确定适宜的NaCl 浓度是筛选耐盐突变体的关键，筛选浓度过低达不到区分亲本和突变体的目的，筛选浓度过高则会严重影响突变体的生长状态［26］。本研究确定甘薯（徐薯18）抗盐突变体的NaCl 筛选浓度为125 mmol·L-1，这与黄瓜［27］、紫茉莉［28］抗盐种质的NaCl筛选浓度差异不大。本研究以甘薯植株的生根率为指标初步筛选突变体，对生根率最高的3 株突变体株系75-2、33-1、52-1 进行形态指标的测定，在盐胁迫下3 株甘薯突变体根长、株高、根鲜重、地上部鲜重、总鲜重均显著高于对照徐薯18。盐胁迫下，植物体内产生大量的活性氧，活性氧产生和清除之间的动态平衡受到破坏，产生过量MDA，使细胞膜流动性下降，膜功能受到损伤［29-31］。SOD、POD、CAT 等保护酶可清除细胞中产生的过量活性氧［4］。因此，植物中保护酶活性和MDA 含量可直接反映植物的抗盐性。本研究筛选到的3 株突变体在盐胁迫下的SOD、POD、CAT 活性均显著高于徐薯18，MDA含量显著低于徐薯18。进一步对盐胁迫相关基因的表达分析发现，180 mmol·L-1NaCl胁迫下，突变体（75-2、52-1、33-1）中IbSOD、IbPOD、IbAPX、IbSOS的表达量均显著高于诱变亲本。综上，推测这3 株突变体的抗盐性优于诱变亲本，为进一步研究甘薯的耐盐性提供了有价值的新材料。

本试验获得了3 株具有抗盐性的徐薯18 突变株，其抗盐性是否属于基因变异以及能否在后代中稳定遗传，仍需进一步研究。为了确定徐薯18 抗盐突变株与亲本间的抗盐性差异是否与基因突变有关，今后将进一步从全基因组水平分析和筛选抗盐突变植株与徐薯18在盐胁迫响应中的差异基因。

4 结论

本研究确定了徐薯18茎段诱变处理14 d后的PYM的半致死浓度为1.00 mg·L-1。徐薯18抗盐材料的NaCl筛选浓度为125 mmol·L-1。通过将经1.00 mg·L-1PYM 处理14 d后的甘薯植株接种到含125 mmol·L-1NaCl 的筛选培养基，共筛选到43株生根的PYM诱变株系。在盐胁迫下，通过生根率筛选出了3株甘薯抗性突变体，其形态和生理指标均显著高于诱变亲本，且抗盐基因表达量也显著高于诱变亲本，表明这3株甘薯突变体具有抗盐性。