模拟海水胁迫下小麦幼苗的质量及生理响应机制

李 菡 李 云 任学军 王 健 郭振清 林小虎，* 韩玉翠，*

（1河北科技师范学院农学与生物科技学院/河北省作物逆境生物学重点实验室，河北 秦皇岛 066004；2河北科技师范学院乡村振兴研究中心，河北 秦皇岛 066004）

盐碱胁迫是主要的非生物胁迫之一，影响植物正常的新陈代谢和生长发育，甚至导致植物死亡［1］。全世界有超过4×109hm2的盐碱地，约占全球盐渍化土壤面积的50%，而我国盐碱化土地面积超过3.7×107hm2［2-3］。在高浓度盐碱成分的土壤中种植农作物往往会造成农作物大幅度减产，甚至绝收［4-5］。小麦是世界上主要的粮食作物之一，也是盐碱地开发利用的主要作物之一［6］；但研究表明，在盐碱条件下，小麦产量损失仍超过60%［7］。因此，深入研究小麦强耐盐碱种质的耐盐碱机理，进而选育耐盐碱、高产的小麦新品种对保障耕地面积和粮食安全具有重要意义［8］。

经过进化，植物其有三种自我调节方式以应对盐碱胁迫，即合成有机调节物质和无机离子进行渗透调节以应对渗透胁迫［9］；把钠离子外排到植物体外或者在细胞内进行离子区隔化从而调节植物体内离子平衡以应对离子胁迫［10］；提高超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶和抗坏血酸酶等保护酶的活性，减少膜脂的过氧化作用以应对氧化胁迫［11］。植物为应对盐碱胁迫引起的过氧化作用而形成的抗氧化系统包括：活性氧（reactive oxygen species，ROS）清除酶，如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化物酶（peroxidase，POD）和过氧化氢酶（catalase，CAT）；参与抗氧化反应的谷胱甘肽还原酶（glutathione reductase，GR）和抗坏血酸过氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）［12-14］；抗坏血酸（ascorbic acid，AsA）、酚类化合物（类黄酮、花青素）、a-生育酚、类胡萝卜素和脯氨酸等非酶抗氧化剂。这些抗氧化酶及非酶抗氧化剂可以清除ROS或减轻ROS过量累积对细胞膜的损伤，进而减缓盐碱胁迫对植物的损伤［15］。赖弟利等［16］发现NaCl胁迫下，叶绿素含量、POD活性与燕麦幼苗耐盐性呈正相关，丙二醛含量与幼苗耐盐性呈负相关。陈春舟等［17］研究表明，在0.20 mol·L-1NaCl溶液胁迫下，小麦的苗长、根鲜重、苗鲜重、根干重、苗干重均低于对照，抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性均较对照升高。Zeeshan等［18］发现，苗期盐处理后，小麦品种间以及根和叶处理间的SOD、POD、CAT、GR 等抗氧化酶活性均存在显著差异。

有关小麦苗期耐盐的形态指标和生理机制已取得一定成果，但我国大部分盐渍化土壤为滨海盐碱土，其最大特点是盐碱组成与海水一致［19］，目前利用模拟海水研究小麦苗期耐盐碱的生理响应机制仍鲜见报道，且不同小麦品种对盐碱胁迫的响应机制存在一定差异。因此，本研究以两个对盐碱胁迫耐受性不同的小麦品种为试验材料，分析模拟海水胁迫下不同盐耐受性小麦品种的形态特点和生理特征，旨在为增强盐碱地小麦的耐受性，扩大盐碱地的利用范围，实现小麦盐碱地的高产栽培提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究以河北省作物逆境生物学重点实验室保存的津农7 号、烟农15、泰农18、师栾02-1、济麦22、山农21、新麦9号、青丰1号、石农952、中麦998、邯5092、济麦229、鲁麦21、烟农836、德抗961 为试验材料，以上材料由西北农林科技大学韩德俊课题组提供。

1.2 试验方法

1.2.1 种子处理及播种 挑拣发育良好、外观相近的种子，置于10%的NaClO 溶液中消毒5 min，用蒸馏水冲洗3～5遍。4 ℃条件下浸种催芽24 h后，挑选长势一致的小麦种子置于盛有等量石英砂的培养盒中，平均种植密度为1株·cm-2，放置于人工气候箱进行培养，设置温度25 ℃，光暗周期为14 h/10 h，空气湿度60%，浇灌霍格兰营养液，间隔2 d换一次。

1.2.2 盐碱胁迫浓度及品种筛选 小麦生长至两叶一心期时，开始进行胁迫，利用0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 倍标准盐碱度模拟海水的霍格兰营养液（标准盐碱度溶液成分见表1），根据作物逆境栽培与种质创新课题组前期研究基础，对6个小麦材料（津农7号、烟农15、泰农18、济麦22、邯5092、济麦229）进行处理，每处理3 次重复，每3 d 更换一次处理液。测定地上部鲜重、地上部干重、根鲜重，计算相对值并分析其差异显著性，确定筛选浓度，并利用此浓度对15 个小麦材料进行处理，在胁迫后0、2、4、6、8、10 d时，每个重复随机选取5株小麦，立即进行形态指标分析。

表1 标准盐碱度模拟海水成分（盐碱度为35‰）Table 1 Simulated seawater composition under standard saline-alkali degree（saline-alkali degree is 35‰）

1.2.3 不同耐盐碱型品种的水培生理试验 利用1.2.2 得到的适宜盐碱筛选浓度（0.6 倍标准盐度模拟海水）对耐盐碱型品种中麦998和敏感型品种济麦229进行水培试验，盐碱胁迫及形态指标测定方法同上；在胁迫第0、第2、第4、第6、第8 天时，每个重复随机剪取10 株小麦的第1 和第2 片叶片，液氮速冻后保存于-80 ℃冰箱，供生理指标分析。

1.2.4 生长发育指标的测定 测量苗高（茎顶端生长点到根茎之间的距离）、根长，并调查小麦苗的根数；使用电子分析天平称量地上部鲜重及根鲜重，然后105 ℃杀青30 min，75 ℃烘干至恒重，称量地上部干重及根干重。

1.2.5 丙二醛含量测定 丙二醛（malondialdehyde content，MDA）含量测定采用试剂盒说明书的方法测定，试剂盒购自苏州科铭生物技术有限公司。MDA 含量计算公式如下：

MDA含量(nmol·g-1FW) = 25.8 ΔA ÷ W ΔAMDA= A532nm- A600nm

式中，A为吸光度；W为样本质量。下同。

1.2.6 抗氧化酶活性测定 过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽还原酶（GR）活性测定采用试剂盒说明书的方法测定，试剂盒购自苏州科铭生物技术有限公司。计算公式如下：

POD活性(U·g-1FW) = 2 000ΔA ÷ W

CAT活性(µmol·min-1·g-1FW) = 4.45(ΔA - 0.001 3) ÷ W

GR活性(nmol·min-1·g-1FW) = 536ΔA ÷ W

ΔAPOD= A测定- A405nm

ΔACAT= A470nm，2min- A470nm，1min

ΔAGR=A340nm- A340nm，180s。

1.2.7 抗氧化非酶类物质的测定 还原型谷胱甘肽（GSH）含量、氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量按照试剂盒说明书中的方法进行测定，试剂盒购自苏州科铭生物技术有限公司。计算公式如下：

GSH(µmol·g-1FW) = 0.667ΔA ÷ W

GSSG(nmol·g-1FW) = 36.23(ΔA + 0.001 1) ÷ W

ΔAGSH=A测定- A空白

ΔAGSSG=A412nm，150s- A412nm，30s。

1.3 数据处理与统计分析

采用Excel 2010 软件进行数据整理并作图，各性状指标以平均值±标准差表示，用DPS 7.05 软件进行方差分析，用最小显著差异法（least sifnificant difference，LSD法）进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 不同耐盐碱型小麦品种筛选

由表2 可知，胁迫至4 d 时，在0.6 倍浓度下6 个品种的相对地上部鲜重和干重、相对根鲜重表现出一致的差异显著性，即济麦229和邯5092的3个指标显著低于其余品种，烟农15、泰农18和济麦22的3个指标显著低于津农7号。因此，确定0.6倍标准盐碱度模拟海水为适宜的耐盐碱筛选浓度。进一步利用0.6 倍标准盐碱度模拟海水的霍格兰营养液对15 个小麦材料进行盐碱处理，对各性状指标进行综合评价（表3），获得极端耐盐碱类型品种中麦998 和极端敏感类型品种济麦229，后续试验以中麦998和济麦229为供试小麦品种。

表2 盐碱胁迫（4 d）下6个品种间形态指标多重比较Table 2 Multiple comparison of morphological indices among 6 varieties under saline-alkali stress（4 d）

表3 小麦品种耐盐碱性鉴定结果Table 3 Determination of saline-alkali tolerance of varieties

2.2 盐碱胁迫对小麦幼苗叶片生长的影响

由图1 可知，济麦229 胁迫至6 d 时，第1 片叶全部黄化；胁迫至10 d 时，第1 和第2 片叶全部黄化萎蔫，且植株不能正常生长。中麦998 胁迫至6 d 时，第1 片叶开始黄化；胁迫至10 d 时，第1 片叶完全黄化萎蔫，第2 片叶开始黄化，但植株仍能保持正常生长。相同盐碱胁迫条件下，中麦998 的生长状况明显优于济麦229。

图1 两小麦品种在盐碱胁迫6～10 d时的生长情况Fig.1 Growth of two wheat varieties under saline-alkali stress at 6-10 d

2.3 盐碱胁迫对小麦形态指标的影响

由表4 可知，与对照相比，盐碱胁迫下济麦229 和中麦998的苗高均从胁迫第4天开始显著降低；随着胁迫时间延长，两品种苗高的降幅除中麦998第8天外均呈增加趋势；中麦998的降幅均小于济麦229，胁迫第10天时两品种降幅均最大，分别为45.20%（济麦229）、34.04%（中麦998）。盐碱胁迫下两品种最大根长随处理天数的增加整体呈先升高后降低的趋势。与对照相比，济麦229 和中麦998 的最大根长分别从胁迫第2 和第4 天时开始显著降低。中麦998 的降幅均低于济麦229，中麦998和济麦229的降幅分别为5.04%～9.35%和8.88%～23.76%。与对照相比，济麦229的初生根数在胁迫2～8 d 时无显著差异，胁迫第10 天时显著下降，降幅为34.74%；中麦998 的初生根数在盐碱胁迫下均无显著差异。

表4 盐碱胁迫对两小麦品种形态指标的影响Table 4 Effects of saline-alkali stress on morphological indices of two wheat varieties

2.4 盐碱胁迫对小麦苗期物质积累的影响

由表5可知，与对照相比，盐碱胁迫下济麦229和中麦998 地上部鲜重前期（0～2 d、0～4 d）均无显著差异，后期（4～10 d、6～10 d）均显著降低，降幅随处理时间的延长呈上升趋势。与对照相比，盐碱胁迫下，济麦229和中麦998 的地上部鲜重分别在胁迫第4 和第6 天时开始显著降低，胁迫至第10 天时分别降低75.15%和48.90%，中麦998的降幅均小于济麦229。济麦229的根鲜重在胁迫至第4 天时开始较对照显著降低，且降幅随着处理天数的增加而逐渐增大。中麦998 的根鲜重在胁迫2～6 d 时较对照显著增加，胁迫8～10 d 时无显著差异。

表5 盐碱胁迫对两小麦品种物质积累的影响Table 5 Effects of saline-alkali stress on substance accumulation in two wheat varieties

在盐碱胁迫下，济麦229的地上部干重在胁迫2 d时最大，但与对照无显著差异，胁迫至4 d 时开始较对照显著下降，且降幅随着处理天数的增加呈先升高后降低趋势。中麦998 的地上部干重在胁迫至2 d 时较对照显著升高，胁迫至4 d时开始较对照无显著差异。与对照相比，济麦229的根干重在盐碱胁迫2～8 d时无显著差异，胁迫至10 d 时显著降低了33.88%；中麦998的根干重在胁迫第2天时无显著差异，胁迫第4天时较对照显著增加62.34%，之后无显著差异。

由图2 可知，与对照相比，济麦229 的根冠比在胁迫第2和第10天时降低，4～8 d时升高，其中4 d时显著升高29.76%；中麦998的根冠比在胁迫第2天时降低，4～10 d时升高，但差异均不显著。

图2 盐碱胁迫对两小麦品种根冠比的影响Fig.2 Effects of saline-alkali stress on root-to-shoot ratio of two wheat varieties

2.5 盐碱胁迫对小麦叶片抗氧化酶活性的影响

由图3-A可知，与对照相比，盐碱胁迫下济麦229的CAT活性在胁迫第2天时显著降低，胁迫4和6 d时显著增加，胁迫8 d时稍有下降但差异不显著。随着处理天数的增加，中麦998的CAT活性在盐碱胁迫下呈先升高后下降趋势，胁迫2～6 d时较对照显著增加，胁迫第8天时无显著差异。中麦998的CAT 活性较对照开始增加的时间早于济麦229，且增加幅度较大。

由图3-B可知，与对照相比，盐碱胁迫下济麦229叶片POD 活性呈上升趋势，胁迫至6 d 时开始显著升高。随着处理天数的增加，中麦998 叶片POD 活性在胁迫下呈先下降后升高的趋势，胁迫第2 天时较对照显著降低，胁迫第4 天时较对照增加但差异不显著，胁迫至6 d时开始显著增加，增幅高于济麦229。

由图3-C 可知，济麦229 的GR 活性在胁迫2～6 d时较对照无显著差异，胁迫第8 天时较对照显著增加。随着处理天数的增加；盐碱胁迫下中麦998 的GR 活性呈先升高后降低的趋势，胁迫第2 天时较对照无显著差异，胁迫第4 天时开始显著增加，增幅大于济麦229。

图3 盐碱胁迫对两小麦品种CAT、POD、GR活性的影响Fig.3 Effects of saline-alkali stress on CAT，POD，GR activities of two wheat varieties

2.6 盐碱胁迫对小麦叶片抗氧化非酶类物质的影响

由图4-A可知，与对照相比，两小麦品种叶片GSSG含量均在胁迫第2 和第6 天时显著增加，中麦998 的增幅大于济麦229，其余处理时间差异不显著。

图4 盐碱胁迫对两小麦品种GSSG含量、GSH含量、GSH/GSSG 比值的影响Fig.4 Effects of saline-alkali stress on GSSG content，GSH contents，GSH/GSSG ratio of two wheat varieties

由图4-B 可知，盐碱胁迫下两小麦品种叶片GSH含量较对照均不同程度增加，且增加幅度随处理天数的增加呈上升趋势。与对照相比，济麦229和中麦998的叶片GSH 含量分别在胁迫第6、第2 天时开始显著增加。相较于济麦229，中麦998叶片GSH含量较对照升高时间早，且增幅大。

由图4-C 可知，两品种的GSH/GSSG 比值在胁迫第2 天时较对照降低，但差异均不显著，济麦229 和中麦998 分别在胁迫第8、第4 天时开始显著增加，且中麦998的增幅大于济麦229。

2.7 盐碱胁迫对小麦叶片MDA含量的影响

由图5可知，盐碱胁迫下，随着处理天数的增加，两小麦品种叶片MDA 含量呈先升高后降低的趋势，胁迫至2 d时开始较对照显著增加。与对照相比，盐碱胁迫下济麦229 的MDA 含量增幅随着胁迫时间的延长而增加，且均高于中麦998。

图5 盐碱胁迫对两小麦品种MDA含量的影响Fig.5 Effects of saline-alkali stress on MDA content in two wheat varieties

3 讨论

3.1 耐盐碱性鉴定与评价

植物耐盐碱种质资源的鉴定与评价是耐盐碱机制研究及培育耐盐碱品种的重要前提和保证［20］。李琳等［21］研究发现，全株干重、地上部鲜重、根鲜重在第1至5 主成分表达式中的系数较大，可作为芸豆苗期耐盐碱性的鉴定指标。李小康等［22］对盐胁迫下的耐盐性综合评价结果表明，盐胁迫条件下141份人工合成六倍体小麦根干/鲜重及干重根冠比的变异程度都较大（＞80%），说明地上部干/鲜重和根鲜重的相对值可作为耐盐碱性评价的重要指标。本研究发现，在盐碱胁迫下，地上部干/鲜重和根鲜重的相对值均较对照降低，且不同品种间存在差异，说明这3 个指标对盐碱胁迫的响应均较敏感，可作为小麦耐盐碱性品种鉴定与评价的指标。

3.2 盐碱胁迫对小麦形态特性的影响

小麦生长发育受盐碱胁迫的影响较大，且影响程度因不同生长发育时期而异［23］。刘妍妍等［19］研究表明，小麦苗期较芽期对人工海水胁迫更为敏感。马雅琴等［24］对28个小麦材料进行耐盐性鉴定表明，苗期盐害指数较小的材料在盐渍土壤上种植表现出较高的保苗率，且最终产量较高。以上研究结果表明苗期是作物耐盐碱的重要时期，因此，本研究对筛选出的两个不同耐盐碱基因型小麦品种进行了盐碱胁迫下苗期形态特征及生理特性的相关研究。根作为吸收水分和营养的主要器官，当植物处于盐碱胁迫下，最先抑制根对水分和营养的吸收，进而影响植物地上部分的生长［25］。任永哲［26］研究表明，盐胁迫能促进小麦幼苗根系鲜/干重的增加。本研究表明，盐碱胁迫导致盐碱敏感型品种济麦229 的根鲜/干重较对照降低，耐盐碱型品种中麦998 的根鲜/干重较对照增加，说明耐盐碱品种会通过根的迅速生长来应对胁迫。同时，本研究表明，随着模拟海水胁迫时间的延长，相较于中麦998，济麦229 的苗高、最大根长、地上部鲜/干重降低，说明盐碱胁迫最终抑制敏感型小麦品种济麦229 的生长，这与冯巩俐等［27］、孙君艳等［28］的研究结果相似。植物不同部位对盐碱的敏感性差异致使植物生物量分配发生变化，根冠比则反映植物在逆境条件下生物量的分配策略［29］。本研究表明，盐碱胁迫下，中麦998 和济麦229 的根冠比在胁迫4～8 d时较对照升高，其中济麦229在胁迫第4 天时较对照显著增加，这可能是由于地上部生长受到抑制，导致根冠比升高。此外，盐碱胁迫对中麦998幼苗生长形态指标的影响明显小于济麦229，说明在盐碱胁迫下耐盐碱型小麦品种中麦998 能够正常完成生长发育进程，而盐碱敏感型小麦品种济麦229 的生长受抑制，最终萎蔫死亡。

3.3 盐碱胁迫对小麦生理特性的影响

植物在正常生理状态下，体内ROS的产生和清除保持一种动态平衡［30］。SOD是清除ROS的活性酶，能催化过氧阴离子发生歧化反应，生成H2O2，进一步在POD、CAT 等抗氧化酶的作用下转化成H2O 和O2，从而提高植物对逆境的耐受能力［30-31］。本研究发现，随着胁迫时间的延长，盐碱胁迫下两品种CAT 活性整体呈现先增加后降低趋势，而POD 活性整体呈现增加趋势，与前人研究结果相似［11，31］，说明两品种在应对盐碱胁迫时前期以调动CAT 途径为主，后期以POD途径为主。本研究进一步发现，与对照相比，中麦998在胁迫第2 天时CAT 活性就开始显著提高，而济麦229 直到胁迫4 d时才显著提高，说明盐碱胁迫下济麦229 对CAT途径的调动晚于中麦998。另外，与对照相比，中麦998 在胁迫至2 d 时的POD 活性显著降低，但CAT 活性显著提高；济麦229 在胁迫至2 d 时的POD 活性无显著差异，但CAT活性显著降低。说明不同耐受性品种的抗氧化酶系统对盐碱胁迫的响应有所不同，植物主要通过提高保护酶活性以维持较高耐盐碱能力来抵御盐碱胁迫的危害。

GR 催化GSSG 转化为GSH，并维持GSH 的还原状态，在防御系统中对清除ROS起着至关重要的作用［32-33］。因此GSH 和GSSG 含量以及GSH/GSSG 比值能很好地反映细胞所处的氧化还原状态。例如，有研究发现，NaCl 胁迫下耐盐小麦和大麦叶片及根系中的GR 活性显著增加［18］，且GSH含量和GSH/GSSG比值增加［34］。本研究表明，模拟海水胁迫下，耐盐碱型品种中麦998 的GSH含量显著高于对照，相比之下，盐碱敏感型品种济麦229 的GSH 含量显著低于对照。同时，中麦998 的GR 活性高于济麦229，能够维持较高的GSH/GSSG 比率，说明中麦998 中GR 活性的增强加速了GSH 的转化，有利于清除植物体内的ROS。

MDA 是脂质过氧化产物之一，其含量通常作为植物耐盐碱性评价的指标［9］。王婧泽等［35］研究发现，玉米体内的MDA 含量随着盐浓度的增大呈先升高后降低的变化趋势。Feki等［36］研究发现，两个小麦品种的MDA含量在NaCl胁迫下显著增加。本研究发现，盐碱胁迫下，随着胁迫时间的延长，两品种小麦叶片MDA 含量呈先升高后降低的趋势，相较于中麦998，济麦229 的MDA 含量升高。说明在盐碱胁迫下，济麦229 植株体内的氧化压力持续增加，细胞膜质过氧化严重，抗氧化能力较低，最终导致植株死亡。

本研究初步探明了中麦998 的耐盐碱特点及生理响应机制。Quan 等［37］研究表明，较低的Na+/K+和高效的抗氧化系统有助于耐盐基因型小麦在盐胁迫下的生长。豆昕桐等［11］研究表明，耐盐型小麦品种可分别通过其较强的K+/Na+和Ca2+/Na+调节能力缓解渗透胁迫和活性氧损伤，从而表现出耐盐特征。为综合分析不同耐盐碱基因型品种的耐盐碱生理机制，后续试验将对K+、Ca2+、Na+含量及其比值等生理指标进行研究。

4 结论

模拟海水胁迫下，小麦幼苗的生长受到抑制，盐碱敏感型品种济麦229 受抑制的程度明显高于耐盐碱型品种中麦998。模拟海水胁迫导致小麦幼苗叶片MDA含量较对照显著上升并引起抗氧化酶POD、CAT、GR活性的提高，中麦998 的抗氧化酶活性高于济麦229。随着胁迫时间的延长，中麦998幼苗叶片的GR 活性高于济麦229，能够维持较高的GSH/GSSG 比率，有利于清除植物体内的ROS，说明耐盐碱品种在苗期可以通过抗氧化酶系统缓解模拟海水胁迫导致的氧化损伤。